基于PCR-DGGE技术的原油降解菌群落结构分析.pdf

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2、教授＾｜ｊｊ｜．，－Ｋｚ＾＾ｓａｎｓ．—天津理二〇穴年—月工大学研究生院独名Ｊ牲乐巧本人卢明所呈交的学位论文是本人在哥师指巧进行的研究作和取，论文中不包含其他得的硏究成果，除了文中特别加Ｗ标注和致谢之处外工大？私或人已经发农或撰写过的研究成果，也不包貪为获得义津理＿其他教育机构的学位或化书而使用过的材辑。与我同＾作的同志对本硏究所做的任何贡献均ｔ化论文中作了明确的说明并衷示了谢意。？ｌ（口ａ期Ｍｉ若月，签李：年学位冷文作者签《：乏贫絲学隹４＾＾丈胶权化巧援牧书‘木学位论文作者完全丫工解大义津理工大孝々义保留、使＂ｊ学位论文的规定。特授权夭津理孝

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4、tyofTechnologyfortheMaster’sDegreeAnalysisinMarineOil-degradingMicrobialCommunityStructureBasedonPCR-DGGEMethodByTangYaoSupervisorWangXiaoliFebruary2016摘要传统筛菌技术已不能达到现代实验目的，基于16SrDNA基因特定片段的扩增和测序分析，DGGE已成为研究微生物群落结构的重要技术之一。它已在各种自然生境的微生物群落组成研究中得到运用，解决了传统方法的片面性。本文立足于天津渤海湾溢油污染的生物修复问题，利用PCR-DGGE技术对原油降解菌群落结

5、构进行初步研究。优化PCR-DGGE的实验条件，利用指纹图谱、条带测序、系统发育树分析对原油降解菌群落结构进行研究，为以后的相关研究提供基础的方法支持。采集天津渤海湾滩涂沉积物中，以原油为唯一碳源，富集的原油降解菌群用于PCR-DGGE实验。实验周期为2个月，7d取样一次，总8个样品。本研究依据不同的细菌DNA提取试剂盒对原油降解菌总DNA的提取效果，确定适用于本实验的试剂盒。通过对PCR体系中引物量、模板量和PCR程序中退火温度、循环数的优化，得到理想的PCR条件。同时也对DGGE实验条件中凝胶浓度、电泳电压与时间进行了优化，确定了DGGE条件。本研究结论如下：（1）在选用的细菌DNA提取试

6、剂盒中，NewProbe试剂盒提取样品的总DNA质量与纯度最优且满足后续实验要求，本研究选用NewProbe试剂盒。（2）优化后的PCR条件为：扩增体系包括25μLMaster、3μLDNA模板、1μLPrimer-1、1μLPrimer-2、20μLddH2O。扩增程序即：94℃预变性4min；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，25个循环、72℃延伸6min。优化后的DGGE条件为凝胶浓度为8%、变性范围为30%-60%、电泳温度为60℃、电压和时间为60v,16h。（3）在实验周期内，根据原油降解菌的DGGE指纹图谱来分析，不同菌进入新环境之后适应时间存在一定差异

7、，但是整体上原油降解菌群的群落结构相对比较稳定，没有出现明显的减弱趋势。（4）由测序结果可知，在群落结构中α变形菌较多。其中玫瑰杆菌属（Roseobacter.sp.）、节杆菌属（Arthrobacter.sp.）、假单胞菌属（Pseudomonassp.）、微球菌属(Microbacteriumsp.)均是常见的原油降解菌属。关键词：DNA提取PCR-DGGE石油烃降解菌群落结构Abstract