实验二 层析技术.doc

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1、实验二层析技术一•概念利用混和物屮各组分理化性质（吸附力、分子形状、大小、分子极性、分子亲和力以及分配系数）的差异，在物质经过两相屮进行分离的一种技术。本世纪初（1903年），俄国植物学家M.CJber发现并使用这一，技术证明了植物的叶子屮不仅有叶绿素，还含有其他色素，实际丄他使用的吸附层析。现在层系法已成为生化、分子生物学及其它学科领域有效的分离、分析工具之一。二.原理c吸附力分子形状、大小层析是利用不同物质，理化性质不同］极性、亲合力而建立起来的技术。分酉己系数「固定相：固体物质或是固定于固体物质上的成分所有

2、层析系统都有两相组成I流动相：可以流动的物质如：水或溶液等混和物要经过此两相与其作用，最后分离。具体过程:在流动相推动下待分离的混和物►通过固定相吋，各组分理化性质存在差异与两相发生作用（吸附、溶解、结合等）能力不同两相屮分配（含量卢固定相作用力弱组分对比）不同，且随着流动相推动，可发生再分配，这样彳匕固定相作用力强组分受到阻力

3、►移动的快jr迁移率差异,受到阻力t►移动的慢」f物质分离f分部收集，可得单一组分。可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核昔酸。分类1.按两相所处物理状态分类气相层析：气液层析（固定相为

4、液体）和气固层析（固定相为固体），流动相为气体液相层析：液液层析（固定相为液体）和液固层析（固定相为固体），流动相为液体2.按层析方式分类柱层析：固定相装于柱内，使样品沿着一个方向移动而分离薄层层析：将适当粘度的I古I定相均匀铺在薄板上，点样后，用流动相展开纸层析：用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开1.根据层析原理分类：常用分类法（1）吸附层析：固定相是固体吸附剂，通过对不同溶质吸附力强弱不同进行分离（2）分配层析：利用两相小的分配系数不同分配系数：当一种溶质在两种给定的互不和溶的溶剂屮分配吋，在一定温度下达

5、到平衡后，溶质在两相屮的浓度比值为一常数，即分配系数（KQKd=Ca/CbCa和Ch分别代表某一•物质在互不相溶的两相，A相（动相）和B相（静相）屮的浓度。（3）离子交换层析：固定相是离子交换剂，各组分与其亲和力不同（4）凝胶层析：固定相是多孔凝胶，根据流动相屮溶质的分子量大小差界进行分离（5）亲和层析：利用固定相载体表而偶联具有特殊亲和作用的配基，与溶质分子发生可逆的特并性结合进行分离（6）金属螯合层析（7）疏水层析（8）反相层析三•凝胶层析（又叫凝胶过滤或分子筛）凝胶层析是指混和物随流动相流经同定相的层析柱吋

6、，混合物屮各组分按其分子大小不同而被分类的技术。1.原理凝胶层析的固定相是凝胶。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样。r不带电荷凝胶特丿讷三维结构I细微多孔—网状常用凝胶有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶等。葡聚糖凝胶介质是由多聚葡聚糖与环氧绿内烷交连而成。最常用的葡聚糖凝胶层析介质是SephadexG系列，不同型号的凝胶用G表示，G代表交联度，从G10到G100。“G”后面的数字表示每10g干胶的吸水量，可根据待分离混和物分子量大小选用不

7、同“G”值的凝胶。2.分离过程：样殆随洗脱液的流动下移。样品作两种运动丁①随洗脱液垂直下移丫②作不定向扩散扩散至小分子物质►凝胶内部一进出，流程长一V下降一后流出大分子物质一►不进入孔内部，只在颗粒间移动一►流程短，先流出分子量大小不同的物质因此得以分离。凝胶层析的原理1.影响凝胶柱层析的主要因素%1层析柱的选择与装填层析柱的大小应根据分离样品量的多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无汽泡。%1流动相一一洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，H的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主

8、耍取决于待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物质,并不使英变性的缓冲液都可用于凝胶层析。%1加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：-•般分级分离吋加样量约为凝胶柱床体积的1%—5%,而分组分离吋加样量约为凝胶柱床体积的10%-25%・%1凝胶再生：葡聚糖凝胶再生使用NaOH(0.2M)和NaCl(0.5M)混合液处理。四.离子交换层析离子交换层析是利用固定相偶联的离子交换基团和流动相解离的离子化合物之间发生可逆的离子交换反应而进行的分离方法。1.原理离子交换交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分

9、离混和物屮各种离子的一利

10、技术。其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒2间的吸引力的作用。离子交换层析的固定相是载有大量电荷的离子交换剂，流动相是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。离子交换剂按其所带电荷性质，分为：阴离子交换剂带正电荷，与混合物屮带负电的组分结合阴离子交换层析阳离子交换剂带负电荷，与混合物屮带正电的组分结合阳离子交换层析常用离子交换剂有：离子交换树脂，