浅谈怎么切好冰冻切片(转载自丁香园).doc

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1、【转帖】冰冻切片技术介绍、制片技巧冰冻包埋组织固定冰冻切片免疫组化操作各类组织实际操作技巧（连载补充）[精华]切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保

2、持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。5微米以下切片不易成功。但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。目前恒冷箱切片机的品种较多。此种切片适用于科研和教学

3、上的连续切片。要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。4．半导体致冷冰冻切片法将组织

4、置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。明胶冰冻切片正是适用于上述情况。⑴环保组织固定液固定后必须充分水洗，洗净。因甲醛对明胶有凝固作用，从而影响明胶溶液浸入组织内部,不宜选用含甲醛类固定液。⑵组织水洗后浸入1

5、2.5%明胶水溶液(以1%石碳酸水溶液配制)，于37℃温箱浸6-24h。⑶移至25%明胶溶液内浸6-24h。⑷25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min。⑸入环保组织固定液固定明胶块1-2日。⑹蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。切片可保存于10%甲醛液中。⑺依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.15ml。先将果糖溶于麝香草酚饱和液，置于56

6、℃温箱内12h，加明胶后在水浴内加温熔化，过滤后加钾矾。于100ml溶液内加甲醛2ml防腐。三、冰冻切片粘片法1．蛋白甘油粘片法冰冻切片粘片法基本上按石蜡切片的粘片处理，但烘烤的温度不超过40℃。待烤干后立即取出，时间过久或温度过高则切片易破碎。烤干后用70%乙醇及蒸馏水洗后即可染色。2．Lillie明胶粘片法将切片放入1%明胶水溶液数分钟，捞出置于载玻片上，将多余液体倾去。入环保组织固定液中固定5min,水洗10min，即可染色。3．乙醇明胶粘片法切片浸入0.1%或0.75%明胶溶液（以40%乙醇配制）数

7、分钟，捞于载片上，经室温短时干燥，入氯仿1min,经95%及70%乙醇洗去氯仿，再经蒸馏水洗后染色。四、冰冻包埋液包埋切片OCTCompound法现在国内外有许多厂家用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘（chuck）上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。常规切片，厚度2-100微米。或者在盛标本的包埋模具内，挤出适量冰冻包埋液，放入组织块或细胞沉淀块，加包埋剂完全淹没组织块，如有气泡可用针头或吸头吸出。速冻：将盛有组织细胞和包埋液的模具

8、，正置于切片机冷室内冰冻10分钟，至包埋液固化。也可将盛有组织的模具置于液氮或-40-70度冰箱冰冻固化保存，用前取出置于切片机冷室内平衡温度（否则损坏刀片）。冰冻包埋液是由高分子聚合物组成的透明粘稠液体，速冷时固化，其冰冻速度和软硬韧度与组织细胞相近，因此能保证最佳O.C.T.，并具有支持填充、减少皱褶和断裂的作用。能切出2-3微米的超薄切片。国内较好的品牌有西奈山冰冻包埋液。冰冻切片——组织块的准备1.调整好