激光共聚焦显微镜原理和操作.ppt

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1、激光扫描共焦显微镜技术样品要求原理功能在生物医学中的应用激光扫描共焦显微镜技术及应用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光扫描共焦显微镜技术人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm二、原理激光扫描共焦显微镜技术原理小结:Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探

2、测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜

3、的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片conventionalconfocal激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别3.增加侧向分辨率激光扫描共焦显微镜技术共焦显微镜与传统显微镜的区别4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响激光扫描共焦显微镜技术三.激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明2.具有照明pinhole和探测pinhole3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具

4、有扫描系统——逐点扫描成像5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物激光扫描共焦显微镜技术技术指标（LeicaTCSSP2):1.xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2.样品的最大厚度:取决于:物镜的NA、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z轴的最大移动范围(166m、Z-wide)3.样品的最小光切厚度:(载物台最小移动距离为40nm）取决于:物镜的NA、针孔大小Z轴的最小移动步距:40nmZ轴的分辨率:0.35m激光扫

5、描共焦显微镜技术4.激光器Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm激光器的特点:1)方向性好:激光基本延直线传播2)单色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合激光扫描共焦显微镜技术5.四个荧光通道,一个透射光通道即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像。激光扫描共焦显微镜技术6.扫描速度:slow220lines/s512512

6、2-3秒slow2440lines/s（2：双向扫描）medium450lines/s5125121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s5125120.7秒1281280.2秒fast22000lines/s7.扫描密度:64641281285125121024102420482048激光扫描共焦显微镜技术的应用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光扫描共焦显微镜应用功能.1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续

7、光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描8.图像处理9.旋转扫描10.感兴趣区域扫描11.光谱扫描激光扫描共焦显微镜应用应用定位、定量三维重组动态测量活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量蛋白质的转位激光扫描共焦显微镜应用活细胞内H+浓度（pH值）的测量线粒体膜电位的测量荧光漂白恢复（FRAP）的测量笼锁解笼锁的测量荧光

8、能量共振转移（FRET）的测量其他应用激光扫描共焦显微镜应用一、定位、定量免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量：如：细胞膜受体或抗原的分布，微