激光共聚焦显微镜的原理和应用new

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1、维普资讯http://www.cqvip.com)一。·232·恙曼盖。普s激光共聚焦显微镜的原理和应用塑杨军，

2、关键词；堡；忙旦一的．焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射中国图书资料分类法分类号。R3185l针孔．焦平面以外的点不会在探测针孔处成像．这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面．激光共聚焦显微镜是8o年代发展起来的克服了普通显微镜图象模糊的缺点。一项划时代意义的高科技新产品．它是在荧光在显微镜的载物台上加一个微量步进马显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用达．可使载物台上下步进移动．最小步进距

3、离为计算机进行图象处理．使用紫外或可见光激发的0．1fm，则细胞或组织各个横断面的图象都荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构能清楚地显示．实现了”光学切片”的目的．这就的荧光图象，在亚细胞水平上观察诸如ca、是“细胞CT”名称的由来。pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，1．2激光共聚焦显微成像仪的图像处理功能成为形态学，分子细胞生物学．神经科学．药理1．2．1“细胞CT”功能通过狭缝扫描技术学．遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真1994年在姜泗长院士的提

4、议下，我院引进正的平面影像水平．使图像更加清晰，从而为分了目前世界上档次最高，功能最全的美国子细胞生物学的深人研究拓宽了视野Meridian公司的产品：Acas系列Ultima型和1．2．2三维成像与细胞内部结构图像相结合扫描速度最快的Insight型两台激光共聚焦仪。的功能激光共聚焦显微成像仪可以将断层图仪器自1995年5月份到货安装以来，已为我像与三维重建图像有机的结合起来．不但能揭院7个科室的10个课题所应用．目前主要开示细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断展的研究内容有：(1)细胞内游离钙的实时

5、监层面积、细胞体积等参数，而且可以给人以三维测；(2)细胞通讯的研究；(3)细胞形态学的研立体的概念例如：可以使细胞旋转起来从而能究。随意观察细胞各个侧面的表面结构1．2．3将形态学、生理学与分子细胞生物学的l基本原理和功能研究相互结合利用激光共聚集显微成像仪不1．1基本原理传统的光学显微镜使用的是但可以观察细胞形态的动态变化，而且用适当场光源．标本上每一点的图象都会受到邻近点的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变的衍射光或散射光的干扰；激光共聚焦显微镜化如细胞内游离Ca、pH值及其它细胞内离利用激光束经照

6、明针孔形成点光源对标本内焦子的实时测定。荧光原位杂交的杂交点观测和平面上的每一点扫描．标本上的被照射点．在探定量分析测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管1．3激光共聚焦显微成像仪的细胞生物学功(PMT)或冷电耦器件(cCCD)逐点或逐线接能收．迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。1．3．1粘附细胞分选技术Ultima型激光共照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭聚焦显微成像仪是目前世界上唯一能对粘附细胞进行分选的仪器．而这种不改变细胞周围培作者单位解放军总医院宴骑仪器中心．北京100853养环境．细胞

7、铺展程度和生长状态的分造方式维普资讯http://www.cqvip.com悦盖g6Sept；IT一是至关重要的。细胞．是一件非常辛苦又花费精力的1=作·但它1．3．2细胞激光显微外科及光陷井技术该可以确保每次都有足够多的细胞供实验使用：仪器可将激光当作一把“光刀子”使用-完成诸从动物的活体上直接取细胞-需要实验人员高如细胞膜瞬间穿孔，染色体切割，神经元突起切超的手术技巧，能准确地摘取标本，并且尽量避除等一系列细胞外科手术，也可以作光陷井操免细胞的丢失和死亡作2．1．2细胞的染色根据各种细胞的特性和1．3．

8、3荧光光漂白恢复技术浚技术用来测活-性，确保每次染色成功，是技术性很强的实验定活细胞的动力学系数通过对活细胞的动力技术，需要一段摸索的时问首先确定加多大浓学系数的测定，可对细胞骨架构成、核膜结构、度的钙敏荧光染料FLUO3／AM一在CO培养大分子组装和径跨膜大分子迁移率等领域进一箱中孵育多长时间．是否需要加去污剂F127步研究。助溶?这些在几次试验以后才能够确定1．3．4光活化技术该技术通过笼锁与解笼2．1．3药物对细胞内游离钙的影响实验没锁测定．可以人为控制多种生物活性产物和其计中加入药物对细胞内游离钙的

9、刺激是上升还它化台物在生物代谢中发挥功能的时间和空是下降或者根本无影响，这些在开始实验前必间。须心中有数，在加药过程中还需要考虑所加药1．3．5细胞膜流动性的测定功能细胞膜流物的PH值，渗透压是否台适，是否会引起细胞动性的定性和定量测定在膜的磷脂酸组成分内钙的变化。药物对细胞内游离钙的作用是瞬析，药物的作用点和温度反应测定等方面有着间上升下降，还是钙的振动。要对出现的实验现重要的意义象作出解释1．3．6胞间通讯的