实验——PCR.ppt

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1、基本PCR技术质粒的三种构型和电泳结果有时仅能看到两个条带。本实验用的pUC19质粒，大小为2686bp。实验原理在PCR反应体系中主要含有下列成分：模板DNA；寡核苷酸引物；dNTP（ATP、CTP、TTP、GTP四种核苷酸的混合物）；高温DNA聚合酶（常用Taq酶）；Mg2+PCR的基本反应步骤：变性退火延伸反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。实验原理PCR的基本反应步骤：变性退火延伸实验原理本实验所用的2Taq混合物，主要成分是：0.1UTaqDNA聚合酶500μMdNTP20mMTris-HC

2、l(pH8.3)100mMKCl3mMMgCl2蓝色染料其它稳定剂和增强剂本实验所用引物，是按照大肠杆菌腺苷脱氨酶的基因设计，该基因的长度约1kb。操作步骤待检DNA模板的准备：取一干净离心管，加入99LddH2O，再加入自己小组所提取的K12s基因组1L，使其稀释至1/100。PCR反应混合液的配制：取4个200L离心管进行编号，1＃管为阳性对照管；2＃管为阴性对照管；3＃、4＃管为反应管。在1＃管内，按照顺序加入下列成分（单位：L）：ddH2O7.5引物P11引物P21阳性对照模板PT0.52Taq混合物10总体积202＃管内，以等体积ddH2O代替阳性对照模板；3＃、4＃

3、管内，以等体积待检DNA模板代替阳性对照模板，分别加入各试剂。操作步骤PCR反应：将上述PCR小管插入PCR仪内，按下列程序运行：94℃预变性5min30个循环（94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸80s）72℃延长5min。结果检测：从4个反应小管内各取PCR扩增产物10L，在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。注意事项每吸取一个试剂，都要更换枪头，防止溶液的污染。避免PCR反应体系的污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回冰浴。往PCR中加入新的试剂时，把枪头伸入液面以下，反复吹吸以使溶液混合。注意EB的毒性，小心避免污染。思考题PCR技术的原理是什么？PCR过程中，

4、DNA的扩增是否可以无限进行？下次实验DNA分子的限制性内切酶消化、片段纯化、连接