第七章 克隆基因的表达及基因干扰.ppt

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1、第七章克隆基因的表达及基因干扰上海交通大学倪培华第七章克隆基因的表达及基因干扰第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术第一节外源基因的表达第一节外源基因的表达二、真核生物表达体系一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系（二）原核表达载体具有的特点（四）包涵体（一）对外源目的基因的要求（三）真核生物基因在原核细胞中的表达一、原核生物表达体系（一）对外源目的基因的要求不应具有5´端非编码区以及内含子结构选择标志启动子翻译起始点和终止序列多克隆位点（二）原核表达载体具有

2、的特点一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系（三）真核生物基因在原核细胞中的表达1.非融合型表达蛋白2.融合型表达蛋白3.分泌型表达蛋白1.非融合型表达蛋白优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致缺点：易被细菌蛋白酶破坏（三）真核生物基因在原核细胞中的表达一、原核生物表达体系常用的非融合型表达蛋白表达原核载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因Tac启动子SD序列AUG起始密码转录终止序列T1和T2一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系2.融合型表达蛋白优

3、点：融合蛋白具有抗原性可以作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏一、原核生物表达体系融合型表达系统主要有His系统GST系统金黄色葡萄球菌蛋白A系统β-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统一、原核生物表达体系3.分泌型表达蛋白可防止大肠杆菌对表达产物的降解，而且能够减轻大肠杆菌代谢负荷和易于恢复表达产物天然构象（四）包涵体1.包涵体的形成2.包涵体的分离与纯化3.包涵体的复性一、原核生物表达体系二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系1.酵母表

4、达载体2.酵母表达外源性基因的形式二、真核生物表达体系（一）酵母表达体系1、酵母表达载体选择性标志复制子启动子上游活性序列终止序列蛋白结构域二、真核生物表达体系2.酵母表达外源性基因的形式非分泌型分泌型二、真核生物表达体系（二）哺乳动物细胞表达体系1.哺乳动物细胞表达载体2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统（二）哺乳动物细胞表达体系1.哺乳动物细胞表达载体(1)原核DNA序列(2)启动子(3)增强子(4)剪接信号(5)遗传标记(6)终止信号和多聚腺苷化的

5、信号二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系细胞系DNA转染方式最初的应用CV-1SV40病毒感染表达野生型、突变蛋白CV-1/293腺病毒感染表达野生型、突变蛋白COS瞬时DEAE-葡聚糖在哺乳类细胞中表达，快速鉴定cDNA克隆，表达突变蛋白。NIH3T3逆转录病毒感染转基因动物、在不同类型细胞中表达鼠成纤维细胞MOP瞬时DEAE-葡聚糖快速鉴定cDNA克隆表达突变蛋白CHO-DHFR稳定DHFR+转染用氨甲喋呤扩增高效稳定表达灵长/啮齿类痘病毒疫苗神经元细胞EB病毒载体HSV病毒载体克隆表达基

6、因转移2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统（1）COS细胞瞬时表达系统（2）CHO细胞稳定表达系统二、真核生物表达体系第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第二节表达产物的分离、纯化与鉴定二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化三、表达产物的鉴定一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化1.粗制品的分离纯化2.精制品的分离纯化二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化三、

7、表达产物的鉴定1.蛋白质样品的制备2.SDS聚丙烯耽胺凝胶电泳3.蛋白质的电转移四、表达产物的鉴定4.靶蛋白的免疫学检测封闭靶蛋白与第一抗体反应与第二抗体反应显色四、表达产物的鉴定四、表达产物的鉴定第三节基因表达干扰技术第三节基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶三、小干扰RNA四、微RNA一、反义核酸技术一、反义核酸技术（二）反义RNA技术（三）反义核酸技术的应用（一）反义寡核苷酸技术一、反义核酸技术（一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制2.反义寡核苷酸的设计与合成3.反义寡核苷酸的修饰4

8、.反义寡核苷酸的给药途径一、反义核酸技术（一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制(1)抑制mRNA的翻译(2)抑制复制或转录(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达一、反义核酸技术2、反义寡核苷酸的设计与合成1）设计①计算机软件预测RNA的二级结构②利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计一、反义核酸技术2）合成①长度一般为15～25个核苷酸②G-C含量为60%～65%一、反