SILAC技术.ppt

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1、蛋白质组体内标记技术─SILAC技术细胞培养稳定同位素标记技术（SILAC）是在细胞培养过程中，利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术，对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析，还可通过质谱图上一对轻一重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平，实现对蛋白质的精确定量。SILAC发展历史稳定核素标记技术的出现依赖于质谱技术的发展及其在小分子化合物定量方面的应用。２０００年左右Ｃｈａｉｔ等以及随后的Ｌａｈｍ等首运用含有１３Ｃ和１５Ｎ的培养基标记微生物进行蛋白相对定量。

2、２００２年，Ｏｎｇ实验室改进了Ｃｈｅｎ等提出的氨基酸核素标记技术，建立了SILAC法。在之后的发展，SILAC技术的适用对象逐步扩大，从最初的哺乳动物细胞标记发展到酵母细胞、植物细胞、整体哺乳动物、组织样品、线虫等众多研究领域。近年来，SILAC技术结合质谱、液质联用已经成为生物医学定量蛋白质的有效方法之一。原理SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术，采用含有轻、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞传代若干代后，细胞内蛋白被同位素稳定标记，将蛋白质等量混合后进行分离和质谱鉴定，根据一级质谱

3、图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量。SILAC基本流程如图1。图1SILAC技术实验流程实验过程中，需要在实验组和对照组细胞的培养基中分别加入含有重型稳定核素（如１３Ｃ、１５Ｎ）或轻稳定核素（如１２Ｃ、１４Ｎ）的必需氨基酸，大约经过５～１０次传代后，测定重型核素的标记效率，确保其在９５％以上。稳定核素标记可以造成质谱中蛋白碎片离子质量的偏移，以此区分序列相同而质量不同的肽段。在细胞标记完成后，根据样品处理同一性原则，将实验组和对照组的细胞或者细胞蛋白等比例混合，经过ＳＤＳ-ＰＡＧＥ或者亲和纯化等方

4、式分离目的蛋白后酶解。酶解通常在胶内进行，常用的酶包括胰酶、Ｌｙｓ-Ｃ、Ａｒｇ-Ｃ等，它们的切割位点为Ａｒｇ或Ｌｙｓ的Ｃ端，因此保证酶解的片段均含有重型或轻型氨基酸，通过比较同一氨基酸序列轻、重稳定核素的丰度比即可完成蛋白质的相对定量。某试剂盒该试剂盒适用于能在DMEM或者RPMI1640培养基生长的细胞，并且提供了用于标记的同位素氨基酸，培养基和透析型胎牛血清。同时可提供重链13C615N4L-精氨酸(Product#89990)以提高同位素标记的覆盖率，如果与Pierce的蛋白质/多肽样品富集kit联

5、合使用，可以极大的提高低丰度蛋白质，细胞表面蛋白，细胞器特异性蛋白，糖基化以及磷酸化等翻译后修饰的检测。特点(1)SILAC技术把时间维度整合到蛋白质组学，从而可以进行蛋白质组的动态变化研究；(2)灵敏度高，样本量要求少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量；(3)采用高分辨率质谱定量，定量结果准确且批次变异小、重复性好；(4)标记是在样品处理前引入，随后进行蛋白质分离、酶切和鉴定，后续实验对样品的影响一致，减少误差；(5)SILAC与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白不受蛋白

6、质性质限制；(6)由于该技术属于体内标记，标记高而且稳定，其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合于进行全细胞蛋白的分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量，而且最近已经将其应用到动物整体水平上的研究。应用定量分析不同处理细胞的蛋白表达丰度变化。对没有相应抗体的蛋白进行准确定量。对正常细胞和疾病细胞的蛋白表达谱进行比较分析。一次性高通量进行大量蛋白质的鉴定和定量分析。1SILAC技术用于差异表达蛋白质组(分子标志物鉴定)的定量分析在不同的时期、不同的分化阶段、不同的生理和病理状态下，细胞、组织表达的蛋白质的组成和含量

7、都是有差异的。差异蛋白质组学正是基于研究这种差异而发展起来的，它旨在动态地反映细胞、组织或生命体在特定状态下所表达蛋白质的变化规律，鉴定差异蛋白。寻找差异位点，发现新的蛋白及其功能。目前SILAC技术在差异蛋白组方面主要用于研究不同状态细胞、细胞与组织及不同状态组织之间的差异蛋白，是寻找疾病／肿瘤生物标志分子的主要策略之一。2SILAC技术有助于翻译后修饰蛋白质的鉴定与修饰位点的确定蛋白质翻译后的修饰是蛋白质组学研究中的一个热点问题。许多蛋白质在翻译后会发生不同的修饰，如磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化等。

8、其中，蛋白质磷酸化是最常见，也是最重要的一种蛋白翻泽后修饰方式。蛋白质的磷酸化在真核生物的信号转导中具有很重耍的作用。为r揭示信号通路及其调节机理，首先要清楚在辑种条件下有哪些磷酸化蛋白，以及磷酸化位点的确定。由于蛋白质的磷酸化是一个动态的过程，这就需要我们对信号通路中的磷酸化过程做定景分析。然而，现在还不能对磷酸化过程进行直接的分析。主要有以下几个原因：①对磷酸化的化学定鼍法效宰很低，当给予外界刺激后，细胞内仅有一小部分的蛋