分子荧光光谱法.ppt

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1、分子荧光光谱法实验Molecularfluorescencespectroscopy分子荧光光谱法测定左旋氧氟沙星片含量光致发光（Photoluminescence）:荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。特点：★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级；★线性范围宽；★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。一。目的和要求学习荧光分光光度计的使用方法掌握荧光分光

2、光度法测定样品含量的基本方法荧光分光光度计上海仪电CRT型二、荧光光谱法基本原理分子的激发与失活1.分子的多重态单重态一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。三重态有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。2.激发态分子的失活:激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态。无辐射跃迁☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。☆内转换：相同多重态的两个电

3、子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。☆系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。辐射跃迁:荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8~10-11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109s-1。辐射能量传递过程荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长

4、为‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；‘2>2>1；二、激发光谱与荧光(磷光)光谱1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射

5、光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。三、荧光的产生与分子结构的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适

6、的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。3.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与

7、其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；4、溶液荧光的猝灭碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。四、仪器结构流程测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；同步扫描技术根据激发和发射单色器在扫描过程中

8、彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的可减少光