0406 细胞的冻存、复苏和运输.ppt

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1、◆AnimalCellEngineering◆Chapter4AnimalCellCulture◆Biologyofcellsinculture◆Fluidforcellculture◆Standardcellculturetechniques◆Establishingacelllineorcellstrain◆CellfreezingandrecoverySection5：细胞的冻存、复苏和运输1.细胞冻存细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。2.细胞复苏在体外培养工作中，常要将体外培养物进行

2、冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。细胞的冻存与复苏要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。冷冻速率：慢冻（？）复苏速率：快融（？）冷冻保护剂：5－15％甘油或二甲基亚砜（DMSO）（？）冷冻保存温度：－196℃（液氮）为什么要加冷冻保护剂v对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。v目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。v具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。v

3、非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存方法1）预先配制冻存液：含10%－

4、20％血清的培养基＋10%DMSO或甘油2）取对数生长期细胞，经胰酶消化（或离心）后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)3）加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。冻存和复苏的原则：慢冻快融慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min（4℃冰箱存放30min）当温度达-25℃以下时，5～10℃/min（-20℃冰箱存放1.5-2h）当温度达-80℃时，可迅速放入液氮中（-70℃冰箱存放4-12h）转入液氮罐，注意登记！简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定

5、于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。冻存和复苏的原则：慢冻快融复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速（800－1000rpm）离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日观察细胞生长情况，若死细胞较多，次日应换液。3.细胞的运输◆贴身运输◆冰瓶运输◆液氮罐运输细胞工程思考题l1、体外培养细胞有哪些类型？什么是细胞系、细胞株？l2、细胞系的生长过程包括哪些主要阶段？每一生长阶段各有什么特

6、征？l3、每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？各期细胞有什么特点？l4、培养细胞与体内细胞相比发生了哪些变化？l5、什么是天然培养基、合成培养基和无血清培养基？无血清培养在实验研究中有什么特殊意义？l6、简述原代培养中的组织块培养法的基本过程。l7、贴壁细胞传代时采用何种方法，其技术关键是什么？l8、简述细胞冻存和复苏的技术要点。细胞培养技术.rm细胞工程l一、常用设备与器材l二、玻璃器材的清洗、包装与消毒l三、过滤器的清洗、包装与消毒l四、培养液的除菌l五、无菌操作l六、细胞的原代培养l七、细胞的传代培养l八、细胞的冻存l九、细胞的复苏