易错PCR获得木聚糖酶XYNH突变株 筛选

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1、易错PCR获得木聚糖酶XYNH突变株筛选（一）项目简介易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。易错PCR技术获得木聚糖酶XYNH突变株筛选，是通过易错PCR技术使木聚糖酶发生突变，从突变株中筛选出木聚糖

2、酶的降解能力、耐热性、酶活性提高的突变株，这些突变株就是我们所需的突变株。（二）国内外研究现状和发展动态1.国内外研究现状木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。国外对木聚糖酶的研究开始的较早。Sorensen，1955年就对动物瘤胃和土壤中的木聚糖酶进行了研究。1992年就已实现了木聚糖酶的工业化生产。目前国际上研究工作主要集中在对微生

3、物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达等（Neeta等，1999；Raffaele等，2004）。自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士(曾宇成等，1987)的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶（Aspergillusphoenicis）中纯化得到了四种木聚糖酶：酶I、酶Ⅱ、

4、酶Ⅲ和酶Ⅳ，并深人研究了活力较高的组分酶Ⅲ的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等（曲音波等，2001）开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp.G6-2分离出两种木聚糖酶XynA和XynB。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。2.发展动态国内外目前对木聚糖酶的研究，主要是提高木聚糖酶的耐热性及低温酶活性。木聚糖酶原酶在国内外市场的发展迅速，占了酶制

5、市场份额的12%左右。世界上规模化生产木聚糖酶的国家有许多，例如：丹麦、爱尔兰、芬兰、日本、加拿大等国家。由于木聚糖酶的半纤维素降解中作用显著，能够将半纤维资源在温和条件下转化为糖，具有很高的经济价值。所以近几年来，各国的科研工作者不断在食品、造纸、饲料、能源与环境等方面研究木聚糖酶的应用技术，并且已经成为各国的科研工作者研究的热点之一，在这方面做出新的突破。（三）研究目的研究目的是提高木聚糖酶在低温条件下的酶活性。木聚糖酶在生物工程中有重要的应用价值，但是生物工程的作用环境往往比较苛刻，所以要求木聚糖酶的物理化学特

6、性比较稳定。如在纸浆和造纸工业中，要生产纸浆需要对木材在高温和较碱性的环境进行处理，纸浆处理的温度大约在60°C，而处理纸浆所采用的pH值在10-11之间；然而很多木聚糖酶最适作用温度在50-60°C，在55°C作用半寿期是一个小时。一般情况下，真菌来源的木聚糖酶在pH4-6酸性范围内起作用；放线菌来源的木聚糖酶和细菌来源的木聚糖酶在pH5-9较广范围内起作用。不仅在造纸业中使用的木聚糖酶需要较高的耐热性和耐碱性，在酿造、饲料、生物降解以及能源与环境中使用的木聚糖酶也需要较高的耐热性和耐碱性。由此看来，在高温和较碱性

7、pH值有较高活性的木聚糖酶需要比较强烈。所以我们的研究的目的就提高木聚糖酶的耐热性和耐碱性。（四）研究内容木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分，占植物细胞干重的35%，是一种丰富的生物质资源，是自然界中除纤维素之外含量最丰富的多糖。木聚糖的结构是一种多聚五碳糖，由β-D-1,4木糖苷键连接起来，并带有多种取代基。木聚糖部分降解可形成低聚木糖，彻底降解则得到五碳单糖：木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖为主。木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-

8、葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。从自然界分离的木聚糖酶大多数反应的最适温度为