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1、扫描电镜生物样品的快速制备方法研究47扫描电镜生物样品的快速制备方法研究徐柏森 冯 汀 刘 刚(南京林业大学电镜室 南京 210037)摘要 本文通过改进菌类和纤毛等娇嫩样品在临界点干燥前的制备程序和适当的缩短梯度脱水的时间,使采用戊二醛单固定处理的样品达到双固定的效果,提高了部分生物样品的制备质量,为制备娇嫩的扫描电镜样品提供了一条简易而快速的制备方法。关键词 扫描电镜;样品制备;临界点干燥在扫描电镜样品制备中,对娇嫩的样品采用没有表面张力作用的临界点干燥法,并在干燥前作戊二醛和 酸双固定处理是保存生物样品真实形貌的优秀方法。但此方法操作复杂,做一批样品要花7～8小时,且后固定的
2、 酸价格昂贵,必须依靠进口。为此,改进制样方法已越来越受到国内外电镜工作者重视。有关资料表明,单用戊二醛固定的样品,在酒精脱水过程中容易产生较大的收[1][2]缩,对保存样品的形态不利。笔者仿效丰岛等人的方法,用鱼肝脏作戊二醛固定后的酒精系列脱水试验时发现,样品的收缩率与脱水时间有很大关系,脱水时间越长,收缩越大,反之,则越小。尤其是样品直接进行70%-90%-100%的酒精脱水时,每步在5分钟以下则几乎没有收缩。将此程序应用于临界点干燥的制备方法,其中以每步脱水5分钟的效果最佳,有些样品甚至比常规方法制备的质量更好。近年来,我室已将此方法多次用于菌类等生物样品的制备之中,效果显著
3、,现报道如下。1 材料和方法1.1 材料 选用活杀的雄鸡喉部气管、接种培育15天的白酱菌孢子、黑曲霉孢子和木霉菌丝。1.2 方法 实验共分4组,第一组为常规对照;第二组为快速的双固定法制备;第三组、第四组均采用戊二醛单固定半小时,脱水和置换时间分别为5分钟和2分钟(见表1)。以上四组样品处理后用CO2临界点干燥仪干燥,喷镀和用SEM观察。2 结果和讨论 从观察结果看,第一组常规对照的图象清晰,结构保存完好,能够满足SEM的观察需要。第二组用快速的双固定法制备的样品结果与对照组一致。第三组为单固定后每步5分钟的方法制备,效果良好。鸡气管的纤毛排列自然,表面组织清晰可见,与对照组效果
4、一致;而白酱菌的效果则比对照组好,孢子颗粒明显比对照组饱满。第四组为单固定后每步处理2分钟的方法制备,效果不理想,鸡气管的纤毛有倒伏,上皮组织不清晰,孢子边缘不清楚。4 中国野生植物资源 第819卷第6期表1 扫描电镜生物样品制备程序第2组第3组第4组第1组步骤双固定快速单固定快速单固定快速常规对照处理5分/次处理5分/次处理2分/次4%戊二醛固定2小时30分钟30分钟30分钟0.1M磷酸15分/次×35分/次×3//缓冲液清洗1%OSO4固定2小时2小时//0.1M磷酸15分/次×35分/次×3//缓冲液清洗30%-50%30%-50
5、%-70%70%-90%酒精梯度70%-90%-100-70%-100%-90%-100%-100%脱水2分/次15分/次5分/次5分/次1:1;0:11:1;0:10:10:1醋酸异戊酯置换15分/次5分/次5分2分干燥CO2临界点干燥(下转51页)肉苁蓉多糖对大黄脾虚模型大鼠的影响51健运,水谷不能运化。则气血生化无源,肌肉瘦削,神疲乏力。本实验用大黄灌服大鼠造成“脾虚”动物模型接近于临床的脾虚症。经大黄灌服后的大鼠出现便溏、消瘦、拱背、纳呆、少动,四肢无力,毛发枯燥、畏寒、体重减轻等表现经肉苁蓉多糖治疗后明显改善,食欲和体重增长率基本恢复到正常水平。由于大黄引起的长期腹泻,严
6、重影响了消化腺的储备力和反应性,导致唾液淀粉酶和胃蛋白酶活力明显低于对照组,而经肉苁蓉多糖治疗后上述两种消化酶活力基本恢复正常。肉苁蓉多糖不仅能恢复消化酶的活性以达助消化之功效外尚能增强免疫,增强体质,无疑在治疗严重消化功能紊乱的疾病中,具有良好的作用。参 考 文 献1 李仪奎.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社.1993:10212 陈 奇.中药药理实验方法学.上海:上海科技出版社.1991:3203 吴咸中,高金亮.脾虚证的现代研究.天津:天津科技翻译出版公司.1992:183(上接48页)实验结果表明,作扫描电镜的娇嫩样品可采用戊二醛单固定的方法制备,关键是要根据不同的
7、情况,选择好适当的脱水时间,脱水时间过长,样品在临界点干燥前就可能产生较大的收缩变形,对保存样品的结构不利,脱水时间过短,则容易造成脱水不充分,图象不清晰。解决了样品在脱水时产生的收缩问题,可不用 酸作后固定,随之,也就可省去用以防止戊二醛和 酸起反应的多次缓冲液清洗。考虑到70%的酒精最接近生物样品的生理状态,且常用于保存样品,效果良好,便将样品脱水直接从70%的酒精开始。至于戊二醛固定时间,按常规操作需2小时以上,亦有资料提出扫描样品的固定时间宜短,笔者用极易脱落
