质粒的构建、转化、筛选和鉴定

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1、重组质粒的构建.转化.筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程屮，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切嗨对载体和1=1的DNA进行切割，产牛利于连接的合适末端。2.学习设计构建重组DNA分子的基木方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。3.学习利用T1DNA连接酶把酶切灰的载体片段和外源日的DNA片段连接起來，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常川的连接方式。4.掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。6.掌握a互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的人小。

2、7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。垂组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有驱2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶廨勿的载体分子和外源DNA分子逹接起來。将重组质粒导入感受态细胞中,将转化后的细胞在选择性培养基''培养，可以通过a互补筛选法備选出至组子，并可通过够勿电泳反PCR检验的方法进行重组子的鉴定。1.重组子的构建酶切时首先要了解口的基因的酶切图谱，选丿IJ的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一

3、种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单-•酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单胭切法两种。本实验采用单梅切法，即只用一种限制性内切卿切割1=1的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选川同样的限制性内切酶处理载体。存构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，其至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和

4、缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后窩盐，先低温后高温”的原则进行反应。（要达到高效率的连接,必须酶切完全,酶切的DNA数量要适当。另外,酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的川量，但是最高不能超过反应总体积的10%,因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%片油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%,就会抑制酶的活性。）连接反应总是紧跟卿切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻

5、的5,-磷酸和3'-011间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接晦是來口T4噬菌体的T4DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数Z比控制在1：（C3）Z间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现彖。反应温度介于嗨作用速率和末端结合速率Z间，一般是16°C,用常用的连接时间为12-16ho1.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同吋与菌龄、外界环境等因素有关

6、。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DM的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变界株，即不含限制性内切嗨和卩基化酶的突变株。1=1前常用的感受态细胞制备方法有CaCb法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌廿油，-70°C可保存半年至一年。经过CaCb处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体

7、细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将巫组后的PUC19质粒在42°C下热击90s,实现转化。2.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并口它们是为其他大量未被转化的受体菌细胞混朵在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分禽有我们所