现代遗传学课程论文

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1、通过拟南芥的多代分析來揭示基于CRISPR/Cas系统的基因修饰的模式、特异性、以及可遗传性朱健康中国科学院大学上海植物逆境研究中心第一部分翻译摘要CRISPRCas系统作为一•种目的基因编辑的强有力工具，已经应用到许多生物中，其中包括植物。然而，所有的关于植物的研究报道中，焦点不是瞬时的系统就是基因经过CRISPKCas系统编辑稳定表达到植株后的子一代。在这项研究屮，我们对拟南芥屮的七个基因在十二个不同的靶位点进行编辑，通过连续几代的观察研究来证实CRISPKCas系统诱导的基因突变的模式、效率、特异性以及可遗传性。带有突

2、变的植株（包括嵌合体、朵合体、双等位基因突变、纯合了）在T1代中占71.2%,在T2代中占58.3%,在T3代中占79.4%。CRISPR/Cas系统诱导的基因突变主耍有lbp长度的片段插入或者短片段的缺失，T1代植株的基因修饰主耍发生在体细胞中，并且在T1代中没有发现基因修饰的纯合子。通过对比，在T2代植株中，发现有22%的植株是经过修饰的基因的纯合了。不需要再在靶位点进行新的修饰，纯合了就可以稳定遗传给下一代。通过检测靶位点以及与靶位点高度同源的序列，其至更深层次通过金基因组测序，没冇发现任何脱靶的突变体。综合我们的结果

3、表明在植物屮CRISPRCas系统是基因修饰的冇用工具，特别是进行定点突变可以产生多种多样的、可遗传的突变体。前吞基因编辑工具对于植物功能基因以及植物生物技术的研究都是至关重要的。CRISP艮Cas系统作为一种高效的基因编辑技术，已经被成功运用到人类细胞系、斑马鱼、以及小鼠中，最近在植物中也得以运用。在这个系统中，利用一个分了量比较小的gRNA來引导核酸内切酶Cas9对目标DNA进行切割，使DNA双链断裂。然后在DNA通过同源重组或者是菲同源末端连接进行修复的过程屮产生基因突变。现在已经证实在植物的原生质体和烟草叶片屮，经过

4、编辑的CRISPRA：as系统可以导致靶基因的突变，也可以使用于瞬时表达分析的突变的标记基因恢复功能（如GFP,把突变的GFP基因导入原生质体，编辑合适的gRNA,引导Cas9对GFP进行切割，然后使GFP恢复功能。更重要的是可以让这些经过编辑的基因在转基因拟南芥、烟草、水稻植株中稳定表达。然而我们不清楚这些基因突变或是恢复只是发牛在体细胞屮述是有一部分发牛在牛殖细胞屮，如果发生在生殖细胞中，可能就可以遗传给下一代。除此之外，对于CRISPRCas系统在植物屮作用的特异性也不清楚。从先前的研究屮可以得知CRISPRCas系统

5、作用人类细胞屮有很高的脱靶率，而在小鼠和斑马鱼屮脱靶率却很低。现在我们的研究发现在拟南芥T1代植株小不管是由CRISPR/Cas系统诱导的植物内源基因的突变还是转入基因的修复主要都发生在体细胞中，然而还有一小部分的基I大I编辑发生在生殖细胞屮，可以通过杂交遗传给T2、T3代，并且遵循经典的孟德尔遗传模式。DNA双链断裂后进行修复的过程屮会产生基因突变，主要是lbp的插入或者是一小段DNA的缺失。通过我们更进一步的测序和分析，在大量的通过CRISPKCas系统转基因的拟南芥株系中没有发现任何脱靶现彖，这就表明在植物屮CRISP

6、RCas系统诱导突变具冇高度特异性。结果1.目的基因修饰的模式和流程通过我们先前的报道，可以知道我们已经成功利用CRISPR/Cas9系统在拟南芥T1代植株屮诱导了BRI1,JAZI1,GAI,CHL1,TT4基因的突变，以及GUUS报告基因功能的修复。并且在T1代屮只发现了野生型和嵌合体植株，没有纯合子、杂合子和双等位基因的突变。在这篇报道中，为了研究CRISPR/Cas9系统是如何突变靶基I大I的，以及突变的基I大I是如何传递到下一代的，我们分析了T2代和T3代植株。GAI基因的相关数据如FigU在拟南芥中，通过导入Ca

7、s9和sgRNA靶向作用于GAI基因。观察T1代早期幼苗的儿片叶子，发现了三种非同源末端连接造成的突变:rl,lbp的替换；d3,3bp的缺失;d4,4bp的缺失(Figi)。我们只是分析了T1代植株及其早期幼苗屮靶基因的突变，并没有分析T1代植株整个发冇过程屮靶基因突变的过程。紧接着，我们又对T2、T3代植株的基因突变以及基因突变模式进行了研究。T2代植株中的突变可以分成五种类型。(Figi)一些T2代植株中出现了GAI双份基因的突变，其中又叮以分为相同的突变即纯合子以及不同的突变即双等位基因突变。T2代植株中＜13突变体

8、纯合子的T3代植株中全部都是(13突变，说明rflCR1SPR/Cas9系统作用，经非同源末端重组产生的d3突变ft]T2代传递到了T3代植株，并口不论这些植株中还有没有Cas9核酸酶，都没有造成其他的突变。相似地，双等位基因突变中d3和d5突变从T2代植株传递到T3代植株过程中出现了性状