CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤可编辑

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1、CaCI2感受态细胞的制备的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B）,挑取单菌落于LB培养基中379摇床培养过夜（约16小时）；2.取lml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37'C摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3.将O.lMCaCg溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5.49下3000g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入100pl预冷0.lMCaCI2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7.4°C下3000g冷冻离心5分钟；8

2、.弃去上清，加入100pl预冷0.IMCaCI2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（一709）。•电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1.前夜接种受体菌（DH5a或DH10B）,挑取单菌落于LB培养基中37°C摇床培养过夜；2.取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在379摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5.49下30

3、00g冷冻离心5分钟；6.弃去上清，加入1500

4、11冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7.49下3000g冷冻离心5分钟8.弃去上清，加入750pl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.49下3000g冷冻离心5分钟10.加入20□冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11.立即使用或迅速置于超低温保存。附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1.细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽最使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD6oo来控制。DH5a菌株ODeoo为0・5时细胞

5、密度是5x107/ml）；2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3.经CaCI2处理的细胞，在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4.化合物及无机离子的影响：在Ca"的基础上联合其他二价金属离子（如Mn"或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6.质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7.一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；感受态细胞

6、转化效率的检验为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/pgDNA,按下面的方法计算感受态细胞的转化效率•计算公式：转化效率=产生菌落的总数/铺板DNA的总量。例如，取（0.1ng/pl）完整的质粒转化100pl的感受态细胞.向转化反应液中加入900川培养液，让细菌恢复一小段时间，取100pl铺板•培养过夜，产生1000个菌落。转化0・1ngDNA,用SOC稀释到lOOOpI后，取1/10涂平板，则涂平板共用0・（HngDNA质粒，所以转化率=1000克隆/0.01ngDNA=105cfu/ng=108cf

7、u/pg・转化效率1x106cfu/pgDNA可满足普通的亚克隆实验；1x107cfu/pgDNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为＞1x1.08cfu/pgDNA高效感受态细胞制备方法一：效率非常高，一般可到10*8,好时可到10*9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。实验试剂：A液：IM,MnCI2：B液：IM,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCI20.10g,KCI1.18g,全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线

8、包扎，然后放入灭菌锅121°C®压灭菌备用。取1管B液（0・6ml）,全部加入C液（46ml）中，混匀后，再用lml移液器加入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。实验步骤：1、划线得到单菌落,379培养箱培养约17小时。2、挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37°C剧烈振荡（300rpms）培养3・4小时。3、将培养温度调至18C剧烈振荡（3280rpms）培养，其余与普通感受态差不多。