大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析PPT课件

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1、大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析主要内容研究背景与意义技术路线结果与分析结论致谢语研究背景与意义大黄鱼属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属,又名黄花鱼、黄瓜鱼、大黄花鱼，是我国特有的经济鱼种，也是福建省的主要养殖种类。随着养殖规模扩大、世代增加，病害问题越来越趋严重，给养殖业造成了巨大的经济损失，阻碍了大黄鱼养殖业的持续发展。因此，从其自身的抗病力入手，提高鱼体自身的免疫力来抵抗病原微生物的侵袭是一个很好的途径。1、Rac蛋白是小分子GTP结合蛋白Ras超家族中最大的亚家族。2、Rac在囊泡运输中发挥着调节作用。3、近来发现,Rac与细胞的吞噬作用有关，是

2、一种免疫相关因子，本实验期望克隆大黄鱼Rac基因序列，为以后进一步研究与分析奠定基础。技术路线拼接cDNA全长分析提取肌肉组织总RNA逆转录成cDNA保守区扩增3’RACE扩增5’RACE扩增分析查找序列设计引物结果及分析1、肌肉总RNA的提取结果图11.5%琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼肌肉总RNARNA条带清晰，表明RNA无明显降解，可用于逆转录cDNA。在200-300bp之间有一条明显条带而阴性对照未扩增出条带，证明反转录反应成功，cDNA模板可用。2、cDNA模板检测结果图2通过扩增β-actin基因检测cDNAM：DNAMarker；1：特异性扩增；2

3、：以水做模板的阴性对照M12图3凝胶电泳检测保守区扩增产物M：DNAMarker；1：以水作为模板的阴性对照；2：特异性扩增可看到一条约530bp的条带，条带较清晰，而阴性对照无条带。表明扩增得到的条带可能就是所需条带，将琼脂糖块回收做后续实验。3、保守区扩增结果M12产物回收产物与载体的连接转化初筛重组子图4凝胶电泳检测菌落PCR产物M：DNAMarker；1：以水作为模板的阴性对照；2:以PCR产物为模板的阳性对照；3-6：菌落PCR4、PCR筛选克隆子结果M123456随机挑4个克隆子均含有约530bp的目的条带，都为阳性克隆5、3’RACE第一轮PC

4、R结果图6凝胶电泳检测3ˊRACE第一轮反应产物M：DNAMarker；1：第一轮反应产物；第一轮扩增得到一条较亮的1100bp左右的条带，阴性对照无条带.6、3’RACE第二轮PCR图7凝胶电泳检测3ˊRACE第二轮反应产物M：DNAMarker；1：第二轮产物第二轮扩增得到一条大小介于250-500bp之间的条带，与目的条带预期大小基本相符，阴性对照无条带，表明该片段可能就是所需片段，将琼脂糖块回收做后续实验。7、3’RACE克隆产物的鉴定结果图8凝胶电泳检测菌落PCR产物M：DNAMarker；1：以水作为模板的阴性对照；2：第二轮PCR产物为阳性对照

5、；3-4：菌落PCR扩增产物两个菌落均含有目的条带8、5’RACE第一轮PCR结果图10凝胶电泳检测5ˊRACE第一轮反应产物M：DNAMarker；1：第一轮反应产物；2：阴性对照第一轮扩增产生100-400bp的拖带，但还没有明显条带9、5’RACE第二轮PCR结果图11凝胶电泳检测5ˊRACE第二轮反应产物M：DNAMarker；1：以水作为模板的阴性对照；2：第二轮PCR产物经第二轮扩增,在300bp左右处有特异性条带出现并且阴性对照无条带产物回收产物与载体的连接转化初筛重组子10、5’RACE克隆产物的鉴定图12凝胶电泳检测菌落PCR产物M：DNA

6、ladder；1：以水作为模板的阴性对照；2：以第二轮PCR产物为阳性对照；3-5：菌落PCR扩增产物3个菌落均含有目的条带图14Rac基因部分序列及由此推测的氨基酸序列图中阴影部分是编码区；下划线标注为终止密码TAA；方框中是加尾信号AATAAA获得的片段大小为1272bp，其中包含的编码区579bp，编码193个氨基酸。5’端非编码区长80bp3’端非编码区长613bp，具有脊椎动物典型的加尾信号AATAA和polyA尾巴结论本实验根据其它动物Rac基因序列设计简并引物，通过RT－PCR和RACE方法扩增出大黄鱼Rac基因cDNA全长1272bp,其中编

7、码区（ORF）为579bp,编码193个氨基酸。致谢语感谢韩芳老师在整个毕业论文设计过程中给予的悉心指导，感谢她对我孜孜不倦的教诲！同时感谢课题组的全体老师和同学给予的鼓励和无私的帮助！