生物技术综合实验报告(原生质体相关)

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1、生物技术综合实验报告（第一部分）实验一工作液的配制.培养基配制、器皿洗涤及灭菌一、实验目的掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。二、原理培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。湿热条件（121°C的蒸汽，10分钟）能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。三、器具和试剂灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2,4-D,IBA,KT（激动

2、素）,IMNaOH及HC1,卡那霉素，头胞霉素，乙酰丁香酮。四、实验内容PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备（一）培养基的配制步骤1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸彳留水，用移液管取所需的母液加入烧杯。2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。3、用NaOH或者稀HCL调剂酸碱值。4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。5、高压灭菌（121°C,15min-20min）o6、冷却，取出，备用。（二）棉花无菌苗培养基的制备1、取25mlMS大量元素母液，称取葡

3、萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为6.0,加入7.5g/l琼脂煮沸。2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。4、灭菌后置于水平的工作台上冷却即可。要求：配制1L（三）拟南芥无菌苗培养基的制备1、拟南芥无菌苗培养基：1/2MS大量元素+蔗糖10g/L,PH值6.0;加入7.5g琼脂高温高压灭菌。2、0.1%琼脂糖：O.lg琼脂糖/100ml蒸馆水;无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121°高压灭菌15分钟。3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。要求：配制0.5L,装1瓶灭菌，灭菌后培养

4、基倒皿。五、注意事项1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。实验二无菌苗的制备一、原理化学灭菌：0.1%升汞（Hgcl2）溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子

5、外植体进行消毒。物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镶子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。二、实验材料、器具和试剂棉花品种YZ1;拟南芥col・0野生型灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镶子,酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精三、实验内容（一）拟南芥无菌苗培养基倒皿1.取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。2.将上次灭菌好的9cm培养皿分开放置超净工作台（超净工作台需先打开）上。3.将融化好的培养基分装于培养

6、皿中（500ml/18-20皿），将皿至于超净台上吹干（二）共培养培养基的配制成分数量成分数量MS大量元素（20倍）50ml2,4-D（0.1mg/ni）1mlNH4NO3（20倍）50ml甘氨酸（1000倍）1ml微量元素（100倍）10niKT（0」mg/ml）1ml铁盐（100倍）10ml葡萄糖30g/L微生素（1000倍）1mlPH值5.85-5.90肌醇（100倍）1ml依次加入上述物质，调PH值5.85-5.90,然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。（三）选择培养基的配制共培养培养基+卡那霉素50m

7、g/L+头弛霉素400mg/L灭菌后，待培养基凉至60度左右加入，混匀，倒皿。（四）棉花无菌苗的制备1、将棉籽用手术剪刀去壳（每人3颗，饱满无病虫害种子）。2、用0」％的升汞灭菌13分钟。3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。4、28€条件下暗培养7天（304培养箱）。（五）拟南芥无菌苗的制备大量法灭菌：将拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入84消毒液：无菌水=1:1的混合液ImL上下摇晃灭菌2min,弃消毒液；加入1ml75%的酒精混匀lmin,然后无菌水清洗4次；加入0.1%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基,吹干

8、，封口。弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周（304培养箱）。五、注意事项所有操作（除数种子）均在超净工作台上进行。六、实验结果一周后观察无菌苗的生长状况