高效液相色谱法原理及其应用

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1、高效液相色谱法（HPLC）主讲人：周媛第一节高效液相色谱法基本原理色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号，最终得到各组分的色谱峰。（一）高效液相色谱法的特点一、与经典液相色谱法比较现代液相色谱法是在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器

2、等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。二、与气相色谱法比较1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相的区别GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，

3、流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件区别GC：加温操作（※对气相色谱分离效率最有影响的因素）HPLC：室温；高压三、高效液相色谱法的特点1．分离效能高2．选择性高3．检测灵敏度高4．分析速度快（二）高效液相色谱法的分类及分离机制※按固定相的聚集状态分类：液液色谱法、液固色谱法按分离机制分类：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱

4、法、空间排阻色谱法及亲合色谱法按流动相与固定相极性的相对强弱分类：正相色谱法、反相色谱法一、※液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱二、※液液分配色谱法（LLC）分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异※正相色谱—固定相极性>流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后柱，适用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。※反相色

5、谱——固定相极性<流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。通常对于亲水固定液采用疏水性流动相三、离子交换色谱法（IEC）※分离机制：利用组分与固定相表面离子的交换能力的差别（与流动相的性质无关）离子交换色谱与紫外－可见检测器适用于检测可离解化合物离子交换色谱与电导检测器结合适用于检测无机离子——离子色谱法（IC）四、空间排斥色谱法（SEC）分离机制：利用组分的分子尺寸与凝胶固定相孔径间的渗透系数的差别按流动相的性质不同：流动相为有机溶剂——凝胶渗透色谱流动相为水溶液—

6、—凝胶过滤色谱主要用于分离生物大分子组分五、亲合色谱法（AC）分离机制：利用组分与固定相表面上配基的专属性亲和作用的差别固定相——具有生物活性的配基键合到载体表面上形成适用于生物样品中酶、抗体、受体等的分离六、化学键合相色谱法（BPC）分离机制：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面，使组分在吸附－分配的过程中分离应用较广泛的色谱法：反相键合相色谱固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较吸附色谱

7、分配色谱离子色谱空间排阻色谱亲和色谱固定相全多孔固体吸附剂固定液载带在固相基体上高效微粒离子交换剂具有不同孔径的多孔性凝胶多种不同性能的配位体键联在固相基体上流动相不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同pH值的缓冲溶液有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂分离原理吸附与解吸溶解与挥发可逆性的离子交换多孔凝胶的渗透或过滤具有锁匙结构络合物的可逆性离解（四）高效液相色谱法的定性定量分析方法与气相色谱法的分析方法基本相同定性分析方法：色谱鉴定法化学鉴定法两谱联用鉴定法定量分析方法：外标法内标法

8、面积归一化法（要求每一个组分都出峰）第二节高效液相色谱仪1．贮液瓶（滤芯，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵、梯洗脱度）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置※（一）输液系统一、储液装置：过滤器二、脱气装置：脱气机流动相脱气：（1）吹氦脱气法（2）加热回流法（3）抽真空脱气法（4）超声波脱气法（5）在线真空脱气