达科为amaxa adherent

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1、Amaxa核转染技术实践研讨与4D原位转染技术讲座唐胜伟应用工程师NFHandling–OptimizedProtocolsStep1Step2Harvestcellsofinterest.Mix&combineTransfertoanAmaxa®CertifiedCuvette.Nucleofector®SolutionwithSupplementCellsDNAorsiRNAStep3Step4Step5SelectNucleofector®RinsecuvettewithTransfertoculturedish.

2、ExpressioncanbeProgram.Insertcuvette.culturemediumdetectedassoonas3-8hourspostPressstartbutton―X‖Nucleofection®.Part1案例分析案例一•NK-92•终体积•培养密度案例二•3T3-L1(Ad10thday)•离心力•清洗液案例三•mouseTcell（cd4+）•原代细胞的健康状况•磁珠分选种类•刺激物的添加时间案例四•DC•种属•成熟与否•人•AmaxaHumanDendriticCellNucleofec

3、torKit•0.5–2x106cells•大鼠•200xgfor10minutes•（国外推荐）AmaxaHumanDendritic•U-002CellNucleofectorKit•转完加500ul培养基Ⅰ•8x105cells•12孔板500ul培养基Ⅱ•200xgfor10minutes•终体积1ml（1:1）•u-002•检测4-8小时、24小时•u-015（结果）•y-001•小鼠•转完加500ul培养基Ⅰ•Amaxa®MouseDendriticCell•12孔板500ul培养基ⅡNucleofector

4、®Kit•终体积1ml（1:1）•2.5x105cells•检测4-8小时、24小时•300xgfor10minutes•不成熟Y-001•成熟AN-001成熟细胞转完后需室温下放10分钟再加400ul预热培养基•转完加400ul培养基Ⅰ•48孔板400ul培养基Ⅱ•终体积0.8ml（1:1）•检测4-8小时、24小时案例五•MSC•种属•操作•HumanMSCkit•DogMSCcell•500,000cells/sample•PmaxGFP2ug•Program(Susanadvice)•A-020•T-020•X-

5、001•X-005•L-029•24hFluorescencemicroscope•Photoimage(Y)•X-001,X-005best•transfecteffection80-90%案例六•原代神经元•消化过度•成纤维细胞案例七•hepG2•非ATCC或自建系%TransfectionefficiencyATCC120DSMZ100806040200HEK293K562CHO-K1HeLaNIH/3T3案例八•复苏后几天内全部死•无阴性对照亡案例九•THP-1•对质粒的量敏感（-）案例十•质粒扩增后表达不稳•无

6、阳性对照定案例十一•microRNA或siRNA剂量效应•与干扰效率Part2要比其他任何人都更了解自己的细胞与实验！•Themoredifficultthe•OttawaHealthcelltype,themoreResearchInstitutenucleofectionisvalued-成功转染的影响因素确认DNA纯度OD值>1.8质粒不含内毒素转染体系终体积<120ul确认细胞培养无支原体、细菌、酵母等污染细胞的离心力不要太大!!!操作细胞的影响最理想的条件–请参照每种细胞的特定protocol:核转染之前的

7、细胞状态会影响最终的结果指数期增长的细胞传代的代数较少没有污染克隆以及不同细胞捐赠者的差异(如：ATCCvs.DSMZ)培养条件核转染之前1-2天，细胞需要传代，以保持细胞在指数生长期冻存的细胞需要在37°C预培养1-2小时。刺激的细胞可能与未刺激的细胞核转染条件不同如IL15,antiCD3,antiCD28,withTcells保持细胞在转染后4小时内培养条件不变支原体污染Dr.JudyKantor,DirectorofR&D,ATCCHeLacellsinfectedwithHeLacellsunin

8、fectedMycoplasmafermantansProgramI-013noDNAnoprogram+DNAProgramI-01357.7%23.0%GFP++DNAGFP+Deadcellsgatedout–xaxisonly细胞来源的差别%TransfectionefficiencyATCC120DSMZ1