技术与方法定量蛋白质组学中的同位素标记技术中国生物工程杂志

《技术与方法定量蛋白质组学中的同位素标记技术中国生物工程杂志》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、技术与方法定量蛋白质组学中的同位素标记技术中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25（12）:56〜61叶雯刘凯于洪华珠*刘丽君（华中师范大学教育部农药与化学生物学重点实验室武汉430079）摘要定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来，由于质谱技术和生物信息学的进步，定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就，但其最显著的成就应该归功于稳定同位素标记技术的应用。该技术使用针对某一类蛋白具有特异性的化学探针来标记目的蛋白质或

2、肽段，同时化学探针要求含有用以精确定量的稳定同位素信号。在此基础上，实现了对表达的蛋白质差异和翻译后修饰的蛋白质差异进行精确定量分析。综述了在定量蛋白质组学中使用的各种同位素标记技术及其应用。关键词同位素标记翻译后修饰定量蛋白质组学收稿日期：20050307修回日期：20050921*通讯作者，电子信箱：hzhong@ccnu.edu.cn随着多个物种基因组测序的完成，人们逐渐认识到单纯从基因组信息并不能完全揭示生命活动的规律。基因在转录、翻译后产生蛋白质的过程中，存在着转录水平、翻译水平的调控，同时还存在着蛋白质的翻译后修饰，而且不同组织、不同的分化程度，在不同的环境下，

3、生物体所表达的蛋白质是不同的。因此，蛋白质组学应运而生，其核心在于系统地识别一个细胞或组织中表达的每一种蛋白质。定量蛋白质组学就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。目前，对复杂体系中的蛋白质进行定量主要有两种方法［1LCI）结合2DE和质谱（massspectrometry,MS）技术及蛋白质数据信息技术对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定。（2）基于稳定同位素标签和液相色谱与质谱联用技术（LCMS/MS）鉴定和定量蛋白质。但研究全部蛋白质投资和难度太大，现在的技术方法还不够成熟。目前蛋白质组学研究的策略之一主要集中在对不同器官或

4、不同时期细胞、组织或体液中蛋白质表达的差异进行鉴定和定量，即试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别，而不在于测定其绝对的浓度［2,3］°目前发展起来的策略之二是，从全蛋白质组学的研究转向亚蛋白质组学的研究，即选择分离一些特异性的蛋白质亚群进行分析。通常，可以利用蛋白质的物理化学特性（如大小、电荷、疏水性）对蛋白质进行二维或三维层析或电泳分离，或是通过密度梯度离心等方案分离细胞器，或是使用特异的化学探针选择性标记部分蛋白（如磷酸化蛋白、糖基化蛋白），并通过化学探针的特异性对标记蛋白进行分离，分离后使用MS进行分析。1选择性标记特异氨基酸定量蛋白质组学的发展目前主要集中在基于蛋

5、白质或肽的稳定同位素标记以及自动化串联质谱技术，化学结构相同但质量不同的稳定同位素标签用于标记两个样品混合物中的蛋白，样品混合之后进行质谱分析。这样，一个样品中的每一个分析物都可以作为与其化学结构相同的另一样品中的分析物的定量标准。1.1半胱氨酸的标记ICAT试剂与串联质谱的结合使用为定量蛋白质组学研究开辟了很好的前景。同位素亲和标签技术（isotopecodedaffinitytag,ICAT）最先由Gygi等［4］发明，该技术是利用同位素亲和标签试剂预先选择性地标记含半胱氨酸的肽类，分离纯化后通过质谱进行鉴定，根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一对肽段离子的强度比例，定

6、量分析它的母本蛋白质在原来细胞中的相对丰度。ICAT试剂的化学结构(图1)主要由三部分组成：专一的化学反应基团(能与蛋A质的半胱饭酸残基的SH专一反应)；中间的连接子(可以结合稳定的同位素)；亲和反应基团(一种生物素亲和标签，能与生物素结合选择分离ICAT标记的多肽)。试剂分为两种形式，连接子含有8个宛原子为“重型”，含有8个氢原子为“轻型”，这两种形式的ICAT试剂质量相差8D(肽段带两个电荷时相差4D)。ICAT技术的过程大概分为3个阶段：(1)利用重型和轻型ICAT试剂分别标记两种不同的蛋白质样本，标记完全后混合，用胰酶水解成大小不同的肽段；(2)使用生物素亲和层析法

7、分离纯化与ICAT试剂反2005,25(12)叶雯等：定量蛋白质组学中的同位素标记技术中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.122005应的肽段；(3)标记的肽段洗脱后经液相色谱再次分离，串联质谱分析峰型一致的一对肽段峰的离子强度，由此即可推断出两种样品中同一种蛋白的相对含量。这种方法允许对一个复杂混合物中的所有蛋白进行同时的鉴定，并对存在于两个或多个蛋白样品中的每种蛋白的丰度差异进行精确的定量。对于ICAT方法的一系列应用已经充分显示岀它精确定量的能力，应用的广泛性以及可重复性。G