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1、经典基因工程上游技术一、总体思路概括为六个字：得、切、接、转、增、检“得”为得到目的片段，以提取的DNA、RNA或含有目的片段的重组质粒为模板，PCR扩增出目的片段，该目的片段已透过引物引入酶切位点，用于后续的连接。“切”为酶切，对含有酶切位点的目的片段和载体酶切，使其暴露出黏性末端。酶切一般为双酶切，可以保证目的片段按设定的方向插入载体中o双酶切又可分两种，一种是两个酶同时酶切目的片段或载体,一种是两种酶分步酶切目的片段或载体。通常我们采取同时双酶切目的片段，分步酶切载体。“接”为连接，即将含有相同黏性末端的目的片段和载体通过连接酶形成
2、一个新的环状质粒。条件通常为16°C过夜连接，也可4°C过夜连接，这两种低温过夜连接的目的是为了减少酶切好的载体自连。“转”为转化，即将连接好的重组质粒导入质粒扩增型大肠杆菌中,冃的是为重组质粒大量扩增做好准备。该实验中最为关键的一步是42°C热击90s,切记掌握好温度和时间。“增”为扩增，即导入大肠杆菌的重组质粒随着大肠杆菌的复制而复制。此步即为转化后加入800ulLB液体培养基，在摇床上扩菌的过程。“检”为检测，即检测重组质粒在哪个菌落中。这是整个基因工程上游技术中最为关键和繁琐的一大步骤，包括a抗生索或蓝白斑的初步筛选，b小提质粒并
3、PCR检测目的片段，c双酶切验证，d最终测序验证。二、具体操作步骤1、PCR扩增目的片段，引物为含有酶切位点引物，模板是含有目的基因的克隆重组质粒，此步扩增和常规PCR不同的是，一定要得到亮度很高的冃的片段，因为此产物要经两次胶回收，每次胶回收都要损失20%的目的片段。具体做法a梯度PCR摸索一个好的退火温度b加大模板量c加大引物量d加大酶量，四考同时引进PCR反应体系。PCR体系：模板4ul,引物各1ul,EXTaq酶0.5ul,其他照常,用水补足25ul,共5管。2、特大孔对PCR产物电泳，切胶回收目的片段，胶回收步骤见试剂盒。其中特
4、别要注意的是最后洗脱一步，洗脱液不可按说明书进行,此步胶回收用30ul洗脱液。因为洗脱液越多，目的片段浓度约低，这样连接越不容易成功。3、对胶冋收产物酶切，此步为两种酶同时酶切目的片段，不同两种酶的酶切条件不一样，可参考TAKARA冃录书，酶切时间4h以上，温度视不同酶而定。酶切体系：目的片段5・8ul,buffer2ul,两种内切酶各1・5ul,用水补足20ul,共做4管，把所有胶回收产物都用完。4、在第3步的同时单酶切载体，作用4h以上后加入碱性磷酸酶以去磷酸化，以防后续连接中发生载体自连。酶切体系：质粒4ul,buffer1ub酶1
5、ul,用水补足10ul,共做8管。酶切4h后，加入去磷酸化酶CIAP每管0・2ul,37°C作用1h,65°C作用30min灭活该酶。切记加入CIAP后不可按说明书进行苯酚、氯仿和异戊醇等抽提，抽提容易使目的片段大量丢失。5、分别对上述两种酶切产物特大孔电泳，切胶回收目的片段和载体,具体操作见胶回收试剂盒。6、对载体进行第二种酶的酶切，体系如第一次酶切，酶切后即可电泳并胶回收，此步无需再加去磷酸化酶。7、对回收好的带黏性末端的目的片段和载体电泳，以确定两者酶切时的比例，目的片段和载体合适的mol比值为2-10：1,当然当某一者浓度低时，可
6、多加低浓度者进行不确定比例的盲连，也有可能连接成功。通常二者浓度都大时连接容易成功，其中一者浓度大，另一者浓度小，连接成功的可能性也还是比较大，两者浓度都低吋连接就比较困难。为了提高连接成功率，我们通常选择两个合适的比例同时连接。连接体系：目的片段和载体按合适比例加入，buffer1ul,T4连接酶1ul,用水补足10ul。如果加入的目的片段和载体有点多，酶切体系可适当的扩增到12ul,此时buffer加入1.2uL连接可在PCR仪上16°C连接，也可直接方法冰箱上层4°C过夜连接。8、转化，将连接产物转化进入DH5a大肠杆菌中。具体步骤
7、如下：A取DH5a感受态细菌冰上溶解20—30minB加入5ul连接产物至感受态细菌，混匀，冰上放置30minC42°C热激90s后冰上放置2minD加入800UILB（感受态每管200ul）混匀37°C180rpm复状1h（4000rpm离心5min可提高菌液浓度，使平板上的有效转化子增多）E取200ul涂布在含有抗生素的LB平板上37°C培养过夜F次日挑菌落9、检测第8步中已加入抗生素初步筛选，但长出来的菌落未必就含有重组质粒。长出的菌落有三种情况，一是含有重组质粒，二是含有空载体，三是不含上述两种质粒，但是能抗加入的抗生素的菌落。我
8、们根据空载体的多克隆位点，即能插入目的片段的地方，在多克隆位点上下位置设计一对鉴定引物，就可很好的区分上述三中情况。假设我们设计的鉴定引物能扩增多克隆位点附近的300bp片段，这300bp片段
