基因工程原理与技术-植物基因工程

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1、植物基因工程1983年，首次获得转基因植物——转基因烟草现在，已获得200多种植物的转基因植株。第一节农杆菌及其转化体系一、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciences)的生物学特征1、形态细胞呈杆状，大小为0.8um×1.5~3.0um，1~4根周生鞭毛，菌落无色、光滑。2、生长条件最适温度：25~30℃，28℃培养；最适pH：6.0~9.03、宿主植物双子叶植物、裸子植物4、侵染宿主的症状及原因冠瘿瘤，Ti质粒(tumorinducingplasmid)的T-DNA。T-D

2、NA是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色体上的DNA片段。二、Ti质粒的结构和功能1、Ti质粒的类型与分区环状双链DNA分子，140~235kb。根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型、农杆菌素碱型(琥珀碱型)。功能区毒性区(Vir区)T-DNA区接合转移区复制起始区章鱼碱型2、T-DNA的结构与功能边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。T-DNA的编码基因3、Vir区的结构与功能

3、30~40kb，有virA~virM等操纵子。virA操纵子：组成型，长约为2.8kb，virA基因。VirA蛋白(92kD)是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物(乙酰丁香酮，AS)，是一种自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活。virG操纵子：组成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白(30kD)为转录激活因子，诱导其他vir基因的表达。virB操纵子：诱导型，virB1~virB11基因。VirB蛋白构成跨膜复合体(T-链复合体运输器)供T-DNA越膜转移。virC操纵子：诱导型，virC1

4、、virC2基因。VirC1蛋白与超驱动序列(离右边界外侧17bp处的一个24bp的保守序列)结合，促进T-DNA加工。virD操纵子：诱导型，virD1~virD4基因。VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链：首先VirD1与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位点剪切。VirD2与T-链的5’端共价结合，并核定位信号，将T-链复合体导向细胞核。virE操纵子：诱导型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssD

5、NA结合蛋白，与T-链结合，参与T-链复合体形成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。virF操纵子：诱导型，virF基因。VirF蛋白(23kD)参与T-链复合体的运输。virH操纵子：诱导型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。三、T-DNA转移至植物细胞的机理(农杆菌介导转化的机理)①植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着；②信号分子的释放积累与VirA蛋白的感应；③VirG蛋白激活与vir基因的诱导表达；④T-链复合体的形成；T-

6、链是指vir基因被诱导表达后加工T-DNA而产生的单链T-DNA。T-链复合体是指结合了VirD2、VirE2蛋白的T-链。⑤T-链复合体的跨膜转运；通过T-链复合体运输器和T菌毛进入植物细胞。⑥T-DNA整合到植物染色体上。四、Ti质粒的改造与转化载体系统的构建野生型Ti质粒不能直接作为植物转化载体：①Ti质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点，基因操作困难，不能直接将外源基因插入其T-DNA中；②T-DNA区的onc基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株

7、的再生；现已通过中间载体途径构建许多植物转化载体系统，主要有共整合载体系统、双元载体系统、隔端载体系统。1、共整合载体系统(cointegratevectorsystem)由卸甲Ti质粒载体、中间表达载体组成。例如：pGV3850、pLGVneo1103AmprpLGVneo1103Cointegrateplasmid2、双元载体系统(binaryvectorsystem)由微型质粒、辅助Ti质粒组成。例如：Bin19、pAL4404双元载体系统比共整合载体系统更优越：①插入外源基因的操作较简单；

8、②转化效率较高。lacZ’3、隔端载体系统与共整合载体系统一样，由卸甲Ti质粒载体和中间表达载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关的T-DNA左右边界序列分别位于两个载体上。共整合载体系统和隔端载体系统统称为一元载体系统或顺式载体系统。双元载体系统也称为反式载体系统。五、Ri质粒载体系统发根农杆菌(Agrobacteriumrhiizogenes)Ri质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型Ri质粒的Vir区与Ti质粒的高度同源，T-DNA区的边界序列与Ti质粒的高度同源，