基因工程原理与技术

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1、第三章基因工程载体载体(vector)是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，其本质是DNA复制子。必备基本条件：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自主复制；②具有合适的限制性内切酶位点；③具有合适的选择标记基因。根据来源和性质不同载体可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体等。根据功能和用途不同载体可分为克隆载体、表达载体(标签载体、分泌载体)、测序载体、转化载体、多功能载体等。根据受体细胞不同载体分为原核生物载体(大肠杆菌载体)、真核生物载体(酵母载体、植物载体、动物

2、载体)。第一节质粒载体质粒载体大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，共同具有复制必需区、选择标记基因、限制性酶切位点(克隆位点)。一、质粒的一般生物学特性质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子，大小为1~200kb以上。存在于细菌(最广泛)、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。1、质粒的分子特性双链环形DNA(绝大多数)、双链线形DNA、RNA(酵母的杀伤质粒)。提取的质粒有三种构型：①闭合环形DNA(超螺旋构型)，②开环形DNA，③线形DNA。2、质粒的复制类型严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝松弛型：不严格受

3、宿主控制，10~200拷贝质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与R1质粒正好相反。大多数质粒载体的复制起始区都来源于pMB1质粒，正常情况下在宿主细胞中可维持至少15个拷贝。氯霉素、或链霉素等存在可使质粒的拷贝数达到几千个。3、质粒的不亲和性质粒的不亲和性(不相容性)是指在没有选择压力的情况下，两种质粒不能够在同一个宿主细胞中稳定地共存的现象。见下图彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(ColE1/pMB1)，而彼此能够共存的亲和的质粒则属于不同

4、的不亲和群(p15A/ColE1或pMB1)。4、质粒的转移性质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。质粒接合型质粒(自我转移质粒):多属于严紧型非接合型质粒(不能自我转移质粒):多属于松弛型质粒的迁移作用是指非接合型质粒在接合型质粒共存时可发生转移的现象。如ColE1(必须具备nic位点、mob基因)二、理想质粒载体必须具备的条件1、天然质粒用作载体的局限性分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适。天然质粒相对分子质量拷贝数单一酶切位点选择性标记pSC1015.8×106（9.09

5、kb）1~3EcoRItetrColE14.2×10620EcoRI大肠杆菌素RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr9.09kb2、理想质粒载体的必备条件①具有较小的分子量和较高的拷贝数；②具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点，multiplecloningsites，MCS)；多克隆位点(多接头，polylinker，或限制性酶切位点库）是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。③具有两种以上的选择标记基因；④缺失mob基因或nic位点；⑤插入

6、外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。三、质粒载体的构建1、载体构建的基本原则①根据基因操作的工作需要；②符合理想载体的必备条件；③选择适合的亲本质粒提供载体元件；④尽量简化构建程序。2、pBR322的构建3个亲本质粒(见图)1、Tn3转座到pMB1上形成pMB3；2、pMB3的EcoRI*片段重排形成了更小的pMB8；3、pSC101的EcoRI*片段与pMB8的EcoRI*片段连接形成pMB9；4、Tn3转座到pMB9上形成pBR312；5、pBR312的EcoRI*片段重排形成pBR313；6、p

7、BR313的EcoRII片段重排形成pBR320；7、pBR313的PstI片段重排形成pBR318；8、pBR320的PstI和HincII双酶切片段与pBR318的PstI和HapI双酶连接形成pBR322。4R1drd19(Tn3)pMB1pMB3pMB8pSC101pMB9pBR312pBR313pBR32011233456pSF2124(Tn3)pBR3187pBR32283、pBR322的改良①进一步降低载体的大小；如pAT153、pXf3等。优点：a、失去了pBR322的HaeII的两个片段，分子量

8、更小，拷贝数高pBR322的1.5~3倍；b、失去了nic位点，更安全。pAT153②引入带单一EcoRI的选择标记；如pBR324(9.1kb，具有大肠杆菌素E1基因和免疫imm基因)、pBR325(氯霉素抗性基因)。③引入lacZ’选择标记基因；如pUC系列载体(见下图)④引入MCS位点；如pUC系列载体(见下图)。lacZ’基因：大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子和β-半