GBT4789.34-2003食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验

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1、GB/T4789.34-2003前言本标准的附录A、附录B是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京市卫生防疫站。本标准主要起草人:杨宝兰、冉陆、李志刚、王淑真、杨大进、贾珍珍。GB/T4789.34-2003食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验范围本标准规定了双歧杆菌的检验方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，随后所有的修改单(不包括勘误的内

2、容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28-2003食品卫牛微生物学检验染色法、培养基和试剂术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1双歧杆菌Bifidobacterium一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽胞，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。3.2双歧杆菌菌落计数enumerationofBifidobacterium在一定条件培养后，所

3、得1m以g)检样中所含双歧杆菌菌落数。4设备和材料4.1恒温培养箱:36℃士10C。4.2恒温水浴锅:46℃士1'C。4.3显微镜:lox一100Xo4.4厌氧培养装置:厌氧罐、厌氧箱。4.5离心机:3000r/min,4.6气相色谱仪:(具有氢火焰检测器FID).4.7架盘药物天平:。g-500g，精度。.5g,4.8灭菌吸管:1ML(具0.01刻度),10mL(具0.1刻度)。4.9灭菌平皿:直径90mm.4.10广口瓶或锥形瓶:300mL,500mL.5培养基和试剂5.10.85%灭菌生理盐水

4、。5.2TPY琼脂培养基:见第A.3章。5.3BI琼脂培养基:见第A.2章。GB/T4789.34-20035.4BBL琼脂培养基:见第A.1章5.5双歧杆菌生化用基础培养基:见第A.4章。5.6PYG液体培养基:见第A.5章。5.7革兰氏染色液:按GB/T4789.28-2003中2.2规定。5.8灭菌液体石蜡5，9甲醇:分析纯5.10三氯甲烷:分析纯。5.11硫酸:分析纯。5.12冰乙酸:分析纯。5.13乳酸:分析纯。5.14乙酸标准溶液:吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移人100ml一容量瓶中.加

5、水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mot/L.5.15乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至。.01-01/1-5.16乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4m工，移人100ml，容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L5.17乳酸标准使用液:将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mot/l_6检验程序检验程序见图分纯革兰氏染色，过氧化氢阵试验菌落计数报告接种we庆氧培养A7'C}72h测定乙酸、乳酸菌种鉴定报告图1操作步骤7.1以无菌操作将充

6、分棍匀的检样25g(mL)放人含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成GB/T478934一20031，1。的均匀稀释液7.2用lmL灭菌吸管吸取1，10稀释液lm工，沿管壁徐徐注人含有gml灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，做成1‘10。的稀释液。7.3另取lml一灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支lmL灭菌吸管。7.4选择2个一3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，各取。.1，试分别加人计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选

7、用2种一3种培养基(B工、BI3、‘rPY培养基)，同时作灭菌生理盐水空白对照。7.5待琼脂表面干后，翻转平皿，放至厌氧罐内.操作全过程须在2Omln内完成7.6将厌养罐置36℃士1℃温箱内培养72h士3h，观察双歧杆菌菌落特征见表1。选取菌落数在3。~30。之间的平板对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查和过氧化氢酶试验过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性、无芽胞、着色不均匀、出现“Y’，或“V”型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。表1双歧杆菌在不同培养基上菌落生

8、长形态特征培养基双歧杆菌特征BI培养基为黄色菌落中等大小，表面光亮，边缘整齐呈瓷白色、奶油色，质地柔软、细腻BBI，培养基为黄色菌落中等大小，表面光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻TPY培养基为黄色菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、细腻7.7菌落计数:根据证实为双歧杆菌的菌落数，计算出平皿内的双歧杆菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果例如，检样1只104倍的稀释液在BBI琼脂平板上，