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1、中华人民共和国国家标准GB4789.34—2016食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布国家食品药品监督管理总局GB4789.34—2016前言本标准代替GB4789.34—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》。本标准与GB4789.34—2012相比,主要变化如下:———增加了双歧杆菌的计数方法;———增加了MRS培养基;———修改了标准的适用范围;———修改了附录B为可选项。Ⅰ
2、GB4789.34—2016食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验1范围本标准规定了双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定及计数方法。本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定。本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌菌种。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36℃±1℃。2.2冰箱:2℃~5℃。2.3天平:感量0.01g。2.4无菌试管:18mm
3、×180mm、15mm×100mm。2.5无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及配套吸头。2.6无菌培养皿:直径90mm。3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基:见A.1。3.2PYG培养基:见A.2。3.3MRS培养基:见A.3。3.4甲醇:分析纯。3.5三氯甲烷:分析纯。3.6硫酸:分析纯。3.7冰乙酸:分析纯。3.8乳酸:分析纯。4检验程序双歧杆菌的检验程序见图1。1GB4789.34—2016图1双歧杆菌的检验程序5操作步
4、骤5.1无菌要求全部操作过程均应遵循无菌操作程序。2GB4789.34—20165.2双歧杆菌的鉴定5.2.1纯菌菌种5.2.1.1样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。固体菌种或真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉。5.2.1.2接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。5.2.2食品样品5.2.2.1样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形
5、瓶或均质袋内,于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。5.2.2.2接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板,或取0.1mL适当稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。5.2.2.3纯培养:挑取3个
6、或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。5.2.3菌种鉴定5.2.3.1涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌为革兰氏染色阳性,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无动力。5.2.3.2生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测。过氧化氢酶试验为阴性。双歧杆菌的主要生化反应见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生
7、物生化鉴定系统。表1双歧杆菌菌种主要生化反应两歧双歧杆菌婴儿双歧杆菌长双歧杆菌青春双歧杆菌动物双歧杆菌短双歧杆菌编号项目(B.bifidum)(Bi.nfantis)(Bl.ongum)(B.adolescentis)(B.animalis)(Bb.reve)1L-阿拉伯糖--+++-2D-核糖-+++++3D-木糖-++d++4L-木糖------5阿东醇------6D-半乳糖d+++d+7D-葡萄糖++++++8D-果糖d++dd+9D-甘露糖-++---10L-山梨糖------3GB47
8、89.34—2016表1(续)两歧双歧杆菌婴儿双歧杆菌长双歧杆菌青春双歧杆菌动物双歧杆菌短双歧杆菌编号项目(B.bifidum)(Bi.nfantis)(Bl.ongum)(B.adolescentis)(B.animalis)(Bb.reve)11L-鼠李糖------12卫矛醇------13肌醇-----+aa14甘露醇------aa15山梨醇------α-甲基-D-葡萄16--+---糖甙N-乙酰-葡萄17-----+糖胺苦杏仁甙(扁桃18---++-甙)19七叶灵--
