武汉大学考研历年真题部分答案

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第一类：诺贝尔奖及发展趋势1、2002简1#——分别以一句话简介1999和2001年诺贝尔奖获奖项目中有关细胞生物学的内容2、2005简1#——简介2002和2004年诺贝尔奖获奖项目中有关细胞生物学的内容主题3、2004简6#——请谈谈如何理解目前生物学研究中分子生物学向细胞生物学回归的现象4、2006简3#——什么是干细胞？概述干细胞的类型与功能，并简要叙述干细胞研究的意义和前景5、2008简6#——最近美国和日本科学家分别将人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞，这一成果在理论上、实践上有何意义？6、2009问答4#-----绿色荧光蛋白（GFP）的发现及研究者获得了2008年诺贝尔化学奖，他们的具体贡献是什么？该成果在细胞生物学有关领域研究中有何应用？简述应用的原理与主要步骤。参考答案：诺贝尔奖获奖项目中有关细胞生物学的内容主题1、1999年，美国科学家甘特·布洛贝尔。他发现了蛋白质内控制蛋白质在细胞内传输和定位的信号。获得诺贝尔医学及生理学奖。2、2000年瑞典科学家阿尔维德·卡尔松、美国科学家保罗·格林加德、奥地利科学家埃里克·坎德尔因在人类脑神经细胞间信号的相互传递方面获得的重要发现，而共同获得诺贝尔医学及生理学奖3、2001年美国科学家利兰·哈特韦尔、英国科学家蒂莫西·亨特、保罗·纳斯因发现了细胞周期的关键分子调节机制，而共同获得诺贝尔生理学及医学奖。4、2002年英国科学家悉尼·布雷内、约翰·苏尔斯顿、美国科学家罗伯特·霍维茨因选择线虫作为新颖的实验生物模型，找到了对细胞每一个分裂和分化过程进行跟踪的细胞图谱，而共同获得诺贝尔医学及生理学奖。5、2003年美国科学家保罗·劳特布尔、英国科学家彼得·曼斯菲尔德因在核磁共振成像技术领域的突破性成就，而共同获得诺贝尔生理学及医学奖。6、2004年美国科学家理查德·阿克塞尔和琳达·巴克，以表彰两人在气味受体和嗅觉系统组织方式研究中作出的贡献，共同获得诺贝尔生理学及医学奖。7、2005年诺贝尔生理学或医学奖授予澳大利亚科学家巴里"马歇尔和罗宾"沃伦，以表彰他们发现了导致胃炎和胃溃疡的细菌——幽门螺杆菌。8.2006年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了控制基因信息流动的基本机制，RNA干扰的发现。9.2007年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥-卡佩奇和奥利弗-史密西斯、英国科学家马丁-埃文斯，这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”而获得这一殊荣的。这些发现导致了一种通常被人们称为“基因打靶”的强大技术。这一国际小组通过使用胚胎干细胞在老鼠身上实现了基因变化。基因打靶技术基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。1．原理首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。目前，在ES细胞进行同源重组己经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。通过基因打靶获得的突变小鼠己经超过千种(相关数据库参见文献)，并正以每年数百种的速度增加。通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。2．实验流程3．特点 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引人、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。4．应用基因打靶技术在基因功能研究中的应用、应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型、应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器等。干细胞：4、2006简3#——什么是干细胞？概述干细胞的类型与功能，并简要叙述干细胞研究的意义和前景答案：干细胞(StemCell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞有两种分类方法，一是根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。第二种分类方法是根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotentstemcell,TSC)、多能干细胞（pluripotentstemcell）和单能干细胞（unipotentstemcell）。胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能或单能干细胞。胚胎干细胞（EmbryonicStemcell，ES细胞）：胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（InnerCellMass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞,说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。造血干细胞造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。干细胞的用途：非常广泛，涉及到医学的多个领域。目前，科学家已经能够在体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养人体胚胎干细胞，并以这样的干细胞为“种子”，培育出一些人的组织器官。干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。利用造血干细胞移植技术已经逐渐成为治疗白血病、各种恶性肿瘤放化疗后引起的造血系统和免疫系统功能障碍等疾病的一种重要手段。科学家预言，用神经干细胞替代已被破坏的神经细胞，有望使因脊髓损伤而瘫痪的病人重新站立起来；不久的将来，失明、帕金森氏综合症、艾滋病、老年性痴呆、心肌梗塞和糖尿病等绝大多数疾病的患者，都可望借助干细胞移植手术获得康复。5、2008简6#——最近美国和日本科学家分别将人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞，这一成果在理论上、实践上有何意义？答案：美国和日本科学家分别将人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞，再一次证明了动物细胞的全能性，同时可能意味着风靡一时的胚胎干细胞克隆技术退出舞台。因为这种被称为“直接改造”的技术不仅能避免人体胚胎克隆技术引发的伦理争议，其高效、便利也为进一步医学应用打开了大门。英国科学家伊恩·威尔默特在一份声明中说:“我们现在可以设想这么一个时代:能够以一种简单方式制造干细胞，任何人身上的组织标本均能培育出任何组织器官。”这项技术尚不能完全取代胚胎细胞克隆技术，因为它现阶段的实验方式存在潜在副作用。美日研究小组利用逆转录酶病毒“改造”皮肤细胞，这种病毒可能使基因产生变异，引发肿瘤等副作用。因此，在评估和克服这一潜在风险前，“万能细胞”还不能用于器官移植等临床应用。6、2009问答4#-----绿色荧光蛋白（GFP）的发现及研究者获得了2008年诺贝尔化学奖，他们的具体贡献是什么？该成果在细胞生物学有关领域研究中有何应用？简述应用的原理与主要步骤。答案：2008年10月8日，日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）、美国科学家马丁·查尔菲（哥伦比亚大学）和钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年（2008）的诺贝尔化学奖。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reportergene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。绿色荧光蛋白应用于骨架和细胞分裂研究（如RNA剪切因子的核内运输、细胞骨架动力和胞内运输），细胞器动力学和泡囊运输的研究（用GFP显示小囊运输、用GFP观察TGN运输），生物发育研究（用GFP观察线虫的神经发育、分析果蝇神经发育的不对称性细胞分裂）等。利用常规的DNA重组技术将GFP基因与目的蛋白基因的编码区连接形成一个单一的融合基因表达载体，然后将这一重组表达载体导入细胞，使融合蛋白得到瞬时或稳定表达，通过检测这些GFP的荧光来测定这些蛋白的位置。或者 利用GFP的荧光特性对某一蛋白的N-或C-末端进行标记，然后借助荧光显微镜或共聚焦显微镜便可对标记的蛋白进行细胞内活体观察。 第二类：细胞生物学常用的研究方法1、2002简7#——扫描隧道显微镜是纳米生物学研究的工具，为何能用来观察活的生物样品？答案：扫描式电子显微镜的电子束不穿过样品，仅在样品表面扫描激发出次级电子。放在样品旁的闪烁晶体接收这些次级电子，通过放大后调制显像管的电子束强度，从而改变显像管荧光屏上的亮度。显像管的偏转线圈与样品表面上的电子束保持同步扫描，这样显像管的荧光屏就显示出样品表面的形貌图像，扫描式电子显微镜的分辨率主要决定于样品表面上电子束的直径。扫描式电子显微镜不需要很薄的样品；图像有很强的立体感；能利用电子束与物质相互作用而产生的次级电子、吸收电子和X射线等信息分析物质成分。扫描隧道显微镜可以在真空、大气、液体（接近于生理环境的离子强度）等多种条件下工作，因为扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，基本上可避免样品的变形，属于非破坏性测量，所以可以用来观察活的生物样品。2、2003简6#——以一种荧光染料检验细胞活性的实验方案和原理答案：碘化丙啶荧光染色鉴定细胞活性1、原理细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。用碘化丙啶(PI)对细胞进行染色,可以区别坏死及正常细胞.细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜.当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,活细胞不着色.荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察2、方案PI染色细胞(1)染色:将瓶中的细胞摇匀,取200μl于1.5ml的离心管中,加入PI20μl,染色15分钟.(2)滴片:取一载玻片,用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察细胞内有荧光的则为坏死细胞，细胞内无荧光的为活细胞。3、2004简1#——细胞生物学的镜检样本制备中为什么必须取材新鲜且迅速固定？透射电镜观察的样品为什么必须事前进行脱水处理答案：因为离体的细胞处在很低的大气压中，膜结构很不稳定，时间长了之后会导致膜结构破坏，整个细胞就支离破碎了，所以必须取材新鲜且迅速固定。电镜标本的制作过程是这样的：戊二醛固定——PBS冲洗——锇酸固定——PBS冲洗——丙酮逐级脱水——树脂（如EPON812）+丙酮渗透——纯树脂渗透——包埋——聚合——修块——超薄切片——柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色——电镜观察。因为包埋剂（树脂）是脂溶性的，疏水性的，经历了由水相——油相——水相的过程，必须事前进行脱水处理。4、2004简5#——FDA、DAPI、Cochicine（秋水仙素）等试剂在细胞生物学研究中的主要用途有哪些？简述其原理。答案：FDA是荧光素2乙酯,研究细胞活性的,活细胞染成蓝色,作用与DAPI,PI相同DAPI可以和双链DNA结合发出荧光.当DAPI和DNA结合时,其荧光信号增强,主要用于细胞染色(染细胞核)秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，被广泛应用于细胞学、遗传学的研究和植物育种的工作中，秋水仙素是诱变多倍体效果最好的药剂之一5、2005简5#——如何检验细胞膜的完整性，简述其原理及操作。碘化丙啶荧光染色检验细胞膜的完整性1、原理细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜.当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使细胞着色.荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察2、方案PI染色细胞(1)染色:将瓶中的细胞摇匀,取200μl于1.5ml的离心管中,加入PI20μl,染色15分钟.(2)滴片:取一载玻片,用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察细胞内有荧光的则为细胞膜不完整，细胞内无荧光的为细胞膜完整。6、2005简6#——请简单谈谈下列仪器的主要用途和特点（1）干涉差显微镜ICM（2）激光共聚焦扫描显微镜Confocal（3）电荷偶联以CCD（4）流式细胞仪（Flowcytometry)（1）干涉差显微镜（ICM，interferencecontrastmicroscope）其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。ICM使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 （1）激光共聚焦扫描显微镜（Confocal)激光共聚焦显微镜有如下优越性：1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。2、可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。3、多维图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。 4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察； 6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。（2）（3）电荷偶联仪（CCD）（ChargeCoupledDevice）电荷藕合器件图像传感器,它使用一种高感光度的半导体材料制成。CCD的结构为三层，第一层是“微型镜头”，第二层是“分色滤色片”以及第三层“感光层”。可用于捕捉清晰动态的信号。（3）流式细胞仪（FlowCytoMeter,FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。7、2006简6#——简述常用的荧光标记与观察技术，列出其主要技术流程答案：（1）细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察。活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。（2）荧光染色鉴定细胞活性用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)对细胞进行染色,可以区别坏死及正常细胞.细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜.当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,活细胞不着色.荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察方案：PI染色细胞(1)染色:将瓶中的细胞摇匀,取200μl于1.5ml的离心管中,加入PI20μl,染色15分钟.(2)滴片:取一载玻片,用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察（3）探针的荧光标记探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析8、2006简7#——相差显微镜、扫描电子显微镜，透射射电子显微镜在细胞生物学研究中各有何用途及特点答案：（1）相差显微镜：相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。用途：相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。（2）扫描电子显微镜：特点：电子显微镜为电子束为介质,由于电子束波长远较可见光小,故电子显微镜分辨率远比光学显微镜高.光学显微镜放大倍率最高只有约1500倍,扫描式显微镜可放大到10000倍以上.扫描电子显微镜有一重要特色是具有超大的景深(depthoffield),约为光学显微镜的300倍,使得扫描式显微镜比光学显微镜更适合观察表面起伏程度较大的试片.可进行多种功能的分析.与X射线谱仪配接,可在观察形貌的同时进行微区成分分析;配有光学显微镜和单色仪等附件时,可观察阴极荧光图像和进行阴极荧光光谱分析等.可使用加热,冷却和拉伸等样品台进行动态试验,观察在不同环境条件下的相变及形态变化等.大部分电子扫描显微镜的抗污染能力低,必须提供真空系统和电源稳压系统.用途：二次电子象,背散射电子象,图象处理及分析,能做各种固体材料样品表面形貌及组织结构的分析.（3）透射子显微镜 特点：因电子束穿透样品后，再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿。在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。样品较薄或密度较低的部分，电子束散射较少，这样就有较多的电子通过物镜光栏，参与成像，在图像中显得较亮。反之，样品中较厚或较密的部分，在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密，则像的对比度就会恶化，甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。用途：透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构9、2006简8#——在进行组织原位杂交定位分析样品时，为什么常用冰冻切片方法，而不用石蜡切片方法组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针操作的长度以100-400nt为宜，过长则杂交率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16-30nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，探针的标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要，去除蛋白质的方法是，用0.2mol/LHCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水。冰冻切片是组织在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min，不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透入细胞或组织，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。石蜡切片是用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。所以常用冰冻切片方法，而不用石蜡切片方法10、2006简9#——细胞工程中。哪些方法诱导细胞融合，各有何特点细胞融合(Cellfusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。病毒诱导融合　病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。用灭活的仙台病毒诱导细胞融合的优点是融合率较高，对各种动物细胞都适宜，并且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；缺点是仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。 聚乙二醇诱导融合　聚乙二醇具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，能够有效地促进植物原生质体和动物细胞的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入聚乙二醇，就会发生细胞凝集作用；在稀释和除去聚乙二醇的过程中，就会发生细胞融合。聚乙二醇诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚。聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。 电场诱导融合　20世纪80年代建立起来的电融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，在相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。11、2007简6#——简述鉴定下列细胞结构的方法：细胞壁、细胞核、淀粉粒、油脂和蛋白质细胞壁：植物细胞壁：先在材料上滴上1滴浓盐酸，然后滴上间苯三酚-酒精液1滴，木质化的细胞壁就染上樱红或紫红色。细菌细胞壁：革兰氏染液，阳性细菌为紫色，阴性细菌为红色。细胞核：席夫（Schiff's）试剂，碱性品红是较强的核染色剂，在孚尔根氏（Feulgen's）反应中作为组织化学试剂，以检查DNA。淀粉粒：遇碘变蓝油脂：苏丹Ⅲ染色后是淡黄色的蛋白质：米氏反应，其中硝基汞试剂作用于细胞中蛋白质侧链上的酪氨酸基，形成红色沉淀12、2007简7#——已知某信号分子（分泌蛋白）引发的下游事件可抑制细胞分裂，我们推测该信号分子的受体可能分布在细胞膜上。请你设计一个实验方案证实（1）该信号分子的受体确实存在于细胞膜上；（2）该信号分子是通过与其受体的结合抑制了细胞分裂。该实验应特别注意哪些关键环节？答案：（1）对信号分子（分泌蛋白）进行荧光标记，加入细胞培养液中，培养一段时间后，在荧光显微镜下观察培养的细胞，观察其表面是否有荧光，如果有，则说明其信号分子的受体存在于细胞膜上，如果没有荧光标记，则说明其信号分子的受体不存在于细胞膜上。（2）进行对照实验，设置三种培养液，1号是不加入信号分子的细胞培养液，2号是加入信号分子的细胞培养液，3号加入大量与信号分子结构相似的抑制剂后，再加入信号分子到细胞培养液，观察细胞分裂的情况，如果1号和3号细胞都正常分裂，只有2号出现不分裂，则说明信号分子是通过与其受体的结合抑制了细胞的分裂。实验应特别注意的环节有：对信号分子进行荧光标记；进行对照实验的3号培养液一定要加入大量（过量）的抑制剂。13、2008简3#——细胞显微操作技术主要可用于哪些生物工程研究？为什么必须采用倒置显微镜？细胞显微操作技术是在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术，细胞拆合、显微注射与现代分子生物学技术相结合用于研究核质关系、细胞内某种mRNA或蛋白质功能，还进行转基因动物、高等动物克隆等方面的研究。因为只有倒置显微镜有操作平台，可放置培养皿，满足显微操作的需要，所以必须采用倒置显微镜。14、2008简4#——请设计实验，用四种方法证实某种细胞是生活的。（1） 台盼蓝染色用0.5%浓度的台盼蓝（Trypanblue）,用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。（2）用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)对细胞进行染色,可以区别坏死及正常细胞，细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜.当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,活细胞不着色.荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察，没有荧光的则为活细胞。（3）用相差显微镜观察活细胞，并可在镜下连续拍摄记录体外培养细胞的活动，如细胞分裂、细胞迁移运动等过程。（4）光脱色恢复技术：用荧光素标记膜蛋白，然后用激光照射细胞表面某一区域，使被照射区的荧光淬灭变暗，然后观察膜上荧光的变化，如果一段时间后，淬灭区域的亮度逐渐增加，最后恢复到与周围的荧光强度相等，则说明细胞是生活的。第三类：细胞周期/调控/分化1、2002论述3#——试述cyclin与CDK在细胞周期调控的作用原理及主要下游事件（P429-436）Cyclin周期蛋白不仅仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化，从而推动细胞周期的前进。分为G1型、G1/S型S型和M型4类，各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。G1期与G1/S期：G1周期蛋白主要包括cyclinD、cyclinE，还有cyclinA，G1期的CDK主要包括CDK2、CDK4和CDK6。cyclinD与CDK4和CDK6结合，cyclinE与CDK2结合。E-CDK2为S期启动所必需，E-CDK2与p107和E2F结合成复合物后，CDK2催化p107磷酸化，使p107失去抑制作用，E2F的作用被显示出来，促进有关基因的转录，促使细胞周期由G1期向S期转化；E-CDK2还直接参与了中心体复制的起始调控。cyclinA的合成开始于G1/S，与CDK2结合。S期：cyclinA-CDK2是S期主要的CDK激酶，位于DNA复制中心，使DNA复制因子RF-A磷酸化并使后者的活性增强。在G2-M期：主要的周期蛋白是cyclinB，也有cyclinA，与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化：如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝集；核纤层蛋白磷酸化促使核膜解体；核仁蛋白磷酸化，促使核仁解体；p60c-src蛋白磷酸化，促使细胞骨架重排；C-abl蛋白磷酸化，促使细胞形态调整等下游细胞周期事件。M期：在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC，将泛素连接在cyclinB和cyclinA上，导致cyclinB和cyclinA被蛋白酶体（proteasome）降解，CDK1激酶活性丧失，被CDK1磷酸化的蛋白质去磷酸化，细胞周期便从M期中期向后期转化，完成一个细胞周期2、2003简7#——经诱变处理发现生活受精卵不能启动分裂，试推测突变基因可能主要涉及哪些生理过程调控（检验点）受精卵要启动分裂必须通过一系列DNA复制延搁检验点：细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点（checkpoint）的严格检控下进行的，当DNA发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。细胞周期检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检验点包括：G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。Weel和cdc25c参与了检验点的调控，在S期，Cdc25c的活性比较低，而Weel的活性比较高，Weel可以促使CDK1磷酸化，抑制CDK1激酶的活性，Cdc25c的活性比较低，不能有效促使CDK1去磷酸化，无法激活CDK1，抑制细胞进入M期，启动细胞分裂。细胞能启动分裂有可能是Weel和cdc25c发生突变，无法完成检验点的协同控制。3、2003论述4#——分别举例说明影响细胞分化的主要原因细胞分化(celldifferentiation)：在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生各不相同的细胞类群的过程。细胞分化是多细胞生物发育的基础与核心；细胞分化的关键在于特异性蛋白质合成；合成特异性蛋白质实质在于组织特异性基因在时间和空间上的差异性表达；差异性表达的机制是由于基因表达的组合调控。影响细胞分化的因素（1）细胞的全能性：细胞经分裂和分化后仍具有产生完整有机体的潜能或特性。如将羊的乳腺细胞的细胞核植入去核的羊卵细胞中，成功克隆了多莉羊，证明即使终末分化的细胞，其细胞核也具有全能性。植物的组织培养，用已经分化的外植体脱分化后再形成新的植株，也证明了植物细胞的全能性。（2）胞外信号分子对细胞分化的影响：一部分细胞会影响周围细胞使其向一定方向分化，称为近端组织相互作用，也称为胚胎诱导。如眼的发生，早期视泡诱导与之接触的外胚层上皮细胞发育成晶状体，随后在视泡和晶状体的共同诱导下外面的表皮细胞形成角膜。如果把早期的视泡移植在头部的其他部位，也可诱导与之接触的外胚层啊与成晶状体。 （3）细胞记忆与决定：信号分子的有效作用时间是短暂的，然而细胞可以将这种短暂的作用储存起来并形成长时间的记忆，逐渐向特定方向分化。如果蝇成虫盘，是一些初级分化的细胞群，在幼虫变态过程中，不同的成虫盘发育为成虫不同的器官，把果蝇幼虫的成虫盘植入成虫体内，连续移植9年，细胞增殖多达1800代，然后将这种成虫盘在移植回幼虫体内依然保留其记忆，照例发育为相应的器官。（4）受精卵细胞质的不均一性对细胞分化的影响:卵母细胞的细胞质除了储存有营养物质和多种蛋白外，还含有多种mRNA，其中多数mRNA与蛋白质结合处于非活性状态，成为隐蔽mRNA，不能被核糖体识别，它们在卵细胞质中呈不均匀分布，卵裂后细胞说携带的信息已经开始有所不同，这种区别又通过信号分子影响其他细胞产生级联效应，这样最胡储存的信息不断被修饰并逐渐形成更精细更复杂的指令，最终产生分化各异的细胞类型。如海胆受精卵的发育。（5）细胞间的相互作用与位置效应。改变细胞所处的位置可导致细胞分化方向的改变，称为位置效应。如在鸡胚发育的原肠胚期，在由脊索细胞分泌的由Shh的基因编码的的信号蛋白的的作用下，靠近脊索的细胞分化形成底板，远离脊索的细胞分化为运动神经元，如将另一个脊索植入鸡胚中线一侧，则会以同样方式诱导底板和运动神经元的发育。（6）环境对性别决定的影响：温度和个体的空间位置信息可影响性别分化。如蜥蜴在24度以下全发育为雌性，在32度以上则全发育为雄性。蜗牛形成上下相互叠压的群体，位于下方的个体发育为雌性，位于上方的个体发育为雄性。（7）染色质变化与基因重排对细胞分化的影响。在马蛔虫卵裂过程中，染色体出现消减或丢失，细胞朝不同方向分化。B淋巴细胞中的DNA经过断裂丢失与重排的复杂变化，从而利用有限的免疫球蛋白基因，可表达出多种抗体。•4、2004论述2#——概述细胞周期蛋白B分裂后期的降解途径、机理和调控因素cyclinB分裂后期的降解途径、机理和调控因素分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destructionbox)。当MPF活性达到最高时，通过泛素连接酶催化泛素与cyclinB结合，cyclinB随之被26S蛋白酶体水解。在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC，APC(anaphasepromotingcomplex)负责将泛素连接到M期周期蛋白上cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解，完成一个细胞周期。泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。在蛋白质的泛素化过程中，E1（ubiquitin-activatingenzyme，泛素激活酶）水解ATP获取能量，通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，然后E1将泛素交给E2（ubiquitin-conjugatingenzyme，泛素结合酶），最后在E3（ubiquitin-ligase，泛素连接酶）的作用下将泛素转移到靶蛋白上。当第一个泛素分子在E3的催化下连接到靶蛋白上以后，另外一些泛素分子相继与前一个泛素分子的赖氨酸残基相连，逐渐形成一条多聚泛素链。泛素化的靶蛋白被蛋白酶体逐步降解，多聚泛素解聚为单个泛素分子，重新被利用。•5、2004论述4#——试述动、植物细胞凋亡的一般过程、特点、常用检测方法及原理答案：细胞凋亡的一般过程：①凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布②凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体③凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化细胞凋亡的生化特征：①细胞凋亡的主要特征是形成大小为180～200bp特征性的DNAladders②凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG积累并达到较高水平细胞凋亡的检测①形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察②DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带 ③TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法④彗星电泳法（cometassay）⑤流式细胞分析：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。6、2005简4#——在某些生物发育的特定时期，一些细胞中的染色体形态会发生巨大变化，简述这些染色体的结构特点及其功能。在某些生物的细胞中，特别是在发育的某些阶段会出现一些特殊的体积很大的染色体，包括多线染色体和灯刷染色体，总称巨大染色体。多线染色体来源于核内有丝分裂，核内DNA多次复制而细胞不分裂，产生的子染色体并行排列，且体细胞内同源染色体配对，紧密结合在一起从而阻止染色质纤维的进一步聚缩，形成体积很大的多线染色体，多线化细胞处于永久间期，并且体积也相应增大。果蝇的唾腺细胞是典型的多线染色体细胞。多线染色体上有一系列交替分布的带和间带，带的数目，心态，大小及分布都很稳定。在发育的某个阶段，多线染色体的某些带区变得疏松膨大而形成胀泡，胀泡是基因活跃转录的形态学标志。灯刷染色体几乎普遍存在于动物界的卵母细胞中，其中两栖类卵母细胞最为典型。灯刷染色体是卵母细胞进行减数分裂第一次分裂时停留在双线期的染色体，它是一个二价体，包含4条染色单体，染色体联会还未解除，可见几处交叉。由染色粒轴丝和两侧伸出的相似侧环构成。灯刷染色体的形态与卵子发生过程中营养物质的储备是密切相关的，大部分DNA以染色粒形式存在，没有转录活性，而侧环是RNA活跃转录的区域，一个侧环往往是一个大的转录单位或几个转录单位组合而成。转录RNA副本3’端借助RNA聚合酶固定在侧环染色质轴丝上，游离5’端捕获大量大白纸形成核糖核蛋白复合物，组成环周围的基质，环的粗细变化表示基质的厚薄和转录RNA的长短。7、2005论述3#——细胞周期受到哪些细胞内因子的调控，调控机理如何，哪些环境因子将对细胞周期产生重要影响Cyclin周期蛋白不仅仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化，从而推动细胞周期的前进。分为G1型、G1/S型S型和M型4类，各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。G1期与G1/S期：G1周期蛋白主要包括cyclinD、cyclinE，还有cyclinA，G1期的CDK主要包括CDK2、CDK4和CDK6。cyclinD与CDK4和CDK6结合，cyclinE与CDK2结合。E-CDK2为S期启动所必需，E-CDK2与p107和E2F结合成复合物后，CDK2催化p107磷酸化，使p107失去抑制作用，E2F的作用被显示出来，促进有关基因的转录，促使细胞周期由G1期向S期转化；E-CDK2还直接参与了中心体复制的起始调控。cyclinA的合成开始于G1/S，与CDK2结合。S期：cyclinA-CDK2是S期主要的CDK激酶，位于DNA复制中心，使DNA复制因子RF-A磷酸化并使后者的活性增强。在G2-M期：主要的周期蛋白是cyclinB，也有cyclinA，与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化：如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝集；核纤层蛋白磷酸化促使核膜解体；核仁蛋白磷酸化，促使核仁解体；p60c-src蛋白磷酸化，促使细胞骨架重排；C-abl蛋白磷酸化，促使细胞形态调整等下游细胞周期事件。M期：在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC，将泛素连接在cyclinB和cyclinA上，导致cyclinB和cyclinA被蛋白酶体（proteasome）降解，CDK1激酶活性丧失，被CDK1磷酸化的蛋白质去磷酸化，细胞周期便从M期中期向后期转化，完成一个细胞周期对细胞周期产生重要影响的环境因子：离子辐射、化学物质作用、病毒感染、温度变化、pH变化等。离子辐射对细胞最直接的影响之一是DNA损伤，DNA损伤后会很快启动DNA损伤修复调控体系，抑制细胞周期运转，直到DNA损伤完全修复，或者最终不能完成修复，细胞走向死亡。化学物质有的可直接参与调控DNA的代谢，影响细胞周期变化，有的可以通过其他途径影响酶类和其他调节因素的变化，改变细胞周期进程。病毒感染也是影响细胞周期进程的主要因素之一，有的病毒感染能快速抑制细胞周期，有的则可以诱导细胞转化和癌变，使整个细胞周期进程发生改变。8、2006简5#——PCC试验中，当M期细胞与S期细胞融合后，S期PCC染色体在光学显微镜下呈现什么形状，为什么？PCC试验中，当M期细胞与S期细胞融合后，出现早熟染色体凝集(prematurechromosomecondensation)现象。S期PCC染色体在光学显微镜下呈现粉末状，因DNA由多个部位开始复制。因为M期细胞具有某种促进细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。MPF，由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。P32是CDC2的同源物，P45是cyclinB的同源物，CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)，因此CDC2又被称为CDK1，激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。9、2007简4#——敲除了某基因的动物细胞内可观察到纺锤体能将染色体拉向两极，但并不出现胞质分裂，分析可能的原因（P375）胞质分裂开始于细胞分裂后期，整个过程包括4个步骤：分裂沟位置的确立，肌动蛋白聚集和收缩环形成，收缩环收缩，收缩环处细胞膜融合并形成两个子细胞。敲除了某基因，纺锤体将染色体拉向两极，但胞质不分裂，可能4个环节中的任何一个环节出现问题，最有可能是肌动蛋白无法聚集，收缩环无法形成，也有可能收缩环无法完成收缩，racE基因在收缩环收缩和细胞膜融合过程中起重要作用。10、2007论述3#——细胞凋亡的形态结构特征和分子机理。（同第5题）11、2008论述4#——检验了四瓶体外培养同步化细胞，得知其细胞周期运转分别是被阻隔在G1、G1/S、S、G2/M监控点之前，试问这四瓶细胞受阻的MPF因子分别是由哪类细胞周期蛋白与哪类CDK组合而成的？受阻的主要生化事件是什么？G1期cyclinD表达，并与CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。细胞周期被阻隔在G1期主要的生化事件包括：DNA损伤，相关的周期蛋白没有合成，转录因子没有释放等。 在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，细胞周期被阻隔在G1-S期主要的生化事件包括：cyclinE与CDK2没有结合，DNA无法开始复制S期：cyclinA-CDK2是S期主要的CDK激酶，位于DNA复制中心，使DNA复制因子RF-A磷酸化并使后者的活性增强。受阻事件：DNA复制没有完成。在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1使底物蛋白磷酸化、受阻的生化事件包括：组蛋白H1不能磷酸化导致染色体不能凝缩，核纤层蛋白不能磷酸化使核膜不能解体等12、2009简4#请设计实验分别来证明已分化的动、植物细胞仍具有全能性。13、2009问答2#-----概述影响细胞分化的可能因素及其作用。14、2009问答3#-----通常情况下，如果染色体未在赤道板排列整齐的话，细胞就不能完成分裂中期向后期的转化，请描述细胞对此的控制机制。P433第四类：信号传导1、2002论述1#——概述G蛋白偶联受体介导的信号通路的组成特点、功能参考：教材P233-2432、2003论述1#——酪氨酸蛋白激酶受体介导的RTK-Ras信号通路的特点、功能参考：教材P245-2493、2004简2#——简述磷酸酰肌醇信号通路的途径、特点、主要下游事件和生理功能参考：教材P237-2414、2006简1#——真核细胞中为何以游离Ca2+,而不是以Na+为胞内第二信使（P238-239）5、2006论述1#——细胞信号传递中有哪些正、负反馈机制来调控信号放大及信号终止（P255-258）6、2007简3#——动物体内细胞外空间通常已有大量的Ca2+,为何肌肉细胞中在肌质网内仍储存高浓度的Ca2+（P140-141）7、2008简2#——为什么蛋白质类型激素的受体皆分布在细胞质膜表面，而甾族类型激素的受体却分布在细胞基质或细胞核之中？参考：教材P2218、2008简5#——某种肌肉遗传病是由于基因突变产生了肌膜上乙酰胆碱受体的自身抗体所引起的，试推测此患者的主要病征及病理原因。参考：乙酰胆碱是重要的神经传导递质，基因突变产生了肌膜上乙酰胆碱受体的自身抗体，致使乙酰胆碱无法与肌膜上的受体相互识别与结合，开启K+通道，肌细胞无法产生动作电位，所以无法产生动作。9、2008论述2#——概述受体酪氨酸激酶介导的RTK-Ras信号通路的特点及功能参考：教材P237-24110、2009问答1#-----试述细胞表面受体介导的信号跨膜传递的种类与分布。（1）离子通道偶联受体（2）G蛋白偶联受体（3）酶连受体第五类：蛋白质的合成、转运、跨膜运输、降解1、2002论述2#——以动物细胞从胞外选择性摄取低密度脂蛋白LDL为例，说明受体介导的网格（或称笼形）蛋白有被小泡内吞的过程及生理意义（P120）2、2003简1#——小肠上皮细胞膜上载体蛋白转运葡萄糖，为何有时是协助扩散、而有时又是协同运输协助扩散：葡萄糖通过质膜进出细胞的方式之一。葡萄糖在载体蛋白的协助下，从高浓度一侧通过质膜向低浓度一侧扩散，但此种方式不消耗代谢能。一般发生在进食后血液中葡萄糖浓度较高的情况。协同运输：动物小肠细胞对对葡萄糖的吸收伴随着Na+的进入，细胞内的Na+离子又被钠钾泵泵出细胞外，细胞内始终保持较低的钠离子浓度，形成电化学梯度，协同运输（cotransport）是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。物质跨膜运动所需要的能量来自膜两侧离子的电化学浓度梯度，而维持这种电化学势的是钠钾泵或质子泵。动物细胞中常常利用膜两侧Na+浓度梯度来驱动，一般发生在血液中葡萄糖浓度较低的情况。3、2003论述2#——分别简述三种不同有被膜泡的结构组分、运行方式和生理作用参考：三类具有代表性的衣被蛋白，即：笼形蛋白（clathrin）、COPI和COPII，个介导不同的运输途径：（一）笼形蛋白衣被小泡笼形蛋白衣被小泡是最早发现的衣被小泡，介导高尔基体到内体、溶酶体、植物液泡的运输，以及质膜到内膜区隔的膜泡运输。笼形蛋白分子由3个重链和3个轻链组成，形成一个具有3个曲臂的形状（triskelion）。许多笼形蛋白的曲臂部分交织在一起，形成一个具有5边形网孔的笼子。笼形蛋白形成的衣被中还有衔接蛋白（adaptin）。它介于笼形蛋白与配体受体复合物之间，起连接作用。目前至少发现4种不同类型的衔接蛋白，可分别结合不同类型的受体，形成不同性质的转运小泡，如AP1参与高尔基体→内体的运输、AP2参与质膜→内体的运输、AP3参与高尔基体→溶酶体的运输。当笼形蛋白衣被小泡形成时，可溶性蛋白动力素（dynamin）聚集成一圈围绕在芽的颈部，将小泡柄部的膜尽可能地拉近（小于1.5nm），从而导致膜融合，掐断（pinchoff）衣被小泡。动力素是一种GTP酶，调节小泡以出芽形式脱离膜的速率。动力素可以召集其它可溶性蛋白在小泡的颈部聚集，通过改变膜的形状和膜脂的组成，促使小跑颈部的膜融合，形成衣被小泡。当衣被小泡从膜上释放后，衣被很快就解体，属于hsp70家族的一种分子伴侣（molecularchaperone）充当衣被解体的ATP酶，一种辅蛋白（auxillin）可以激活这种ATP酶。（二）COPI衣被小泡负责回收、转运内质网逃逸蛋白（escapedproteins）返回内质网。起初发现于高尔基体碎片，在含有ATP的溶液中温育时，能形成非笼形蛋白包被的小泡。进一步的研究发现这种衣被蛋白复合体包含多达7种肽链。 内质网向高尔基体输送运输小泡时，一部分自身的蛋白质也不可避免的被运送到了高尔基体，如不进行回收则内质网因为磷脂和某些蛋白质的匮乏而停止工作。内质网通过两种机制维持蛋白质的平衡：一是转运泡将应被保留的驻留蛋白排斥在外，例如有些驻留蛋白参与形成大的复合物，因而不能被包装在出芽形成的转运泡中，结果被保留下来；二是通过对逃逸蛋白的回收机制，使之返回它们正常驻留的部位。内质网的正常驻留蛋白，不管在腔中还是在膜上，它们在C端含有一段回收信号序列（retrievalsignals），如果它们被意外地逃逸进入转运泡从内质网运至高尔基体cis面，则cis面的膜结合受体蛋白将识别并结合逃逸蛋白的回收信号，形成COPI衣被小泡将它们返回内质网。内质网腔中的蛋白，如蛋白二硫键异构酶和协助折叠的分子伴侣，均具有典型的回收信号Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。内质网的膜蛋白（如SRP受体）在C端有一个不同的回收信号，通常是Lys-Lys-X-X（KKXX，X：任意氨基酸），同样可保证它们的回收。COPI衣被小泡还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。（三）COPⅡ衣被小泡介导从内质网到高尔基体的物质运输。COPII衣被由多种蛋白质构成，其中Sar1GTP酶与Sec23/Sec24复合体结合在一起，形成紧紧包围着膜的一层衣被，Sec13/Sec31复合体形成覆盖在外围的一层衣被，Sec16推测可能是一种骨架蛋白，Sec12是Sar1的鸟苷酸交换因子。真核生物的COPII衣被蛋白亚单位具有一些横向同源物（Paralog），这些同源物可能介导不同的蛋白质转运，具有不同的调节机制。这些成分具有改变膜的形状和掐断运输小泡的功能。COPII衣被小泡形成与内质网的特殊部位，称为内质网出口（exitsites），这些部位没有核糖体，由交织在一起的管道和囊泡组成网络结构。由内质网到高尔基体的蛋白转运中，大多数跨膜蛋白是直接结合在COPII衣被上，但是少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COPII衣被结合，这些受体在完成转运后，通过COPI衣被小泡返回内质网。4、2004论述3#——分述下列4种蛋白质的合成部位、转运途径和组装场所：G蛋白偶联受体（膜蛋白）、RuBP羧化酶（叶绿体蛋白）、酸性磷酸酶（溶酶体蛋白）、核糖体蛋白G蛋白偶联受体（膜蛋白）：蛋白合成起始后转移至糙面内质网，在内质网上形成7次跨膜蛋白结构，通过COPII转运小泡转运至高尔基体进行修饰和分选，通过网格小泡转运到细胞膜表面。RuBP羧化酶（叶绿体蛋白）：蛋白质在细胞质中的多聚核糖体上合成，在转运肽的导向下运输到叶绿体的基质中。酸性磷酸酶（溶酶体蛋白）：蛋白合成起始后转移至糙面内质网，在内质网腔内完成合成后，通过COPII转运小泡转运至高尔基体进行糖基化修饰和分选，在M6P受体和溶酶体酶的识别序列导向下进入溶酶体内。核糖体蛋白：在核仁内合成，运输到细胞至内进行组装5、2005论述1#——为什么在内质网上进行共转移的信号肽仅为一段导向信号序列，而在线粒体和叶绿体膜上后转移的导肽和转运肽中却往往包含有两段（或两段以上）的导向序列（P159-161，202-203）6、2006简2#——细胞质膜外表面也存在M6P（甘露糖-6-磷酸）受体蛋白，试解释其功能（溶酶体的发生有关P196）一部分含有M6P标志的溶酶体酶会通过运输小泡直接分泌到细胞外,在细胞质膜上存在依赖与钙离子的M6P受体,它可与胞外的溶酶体酶结合,在网格蛋白协助下通过受体介导的胞吞作用,将酶送至前溶酶体中,M6P受体可返回细胞膜反复使用.7、2006论述4#——简述膜泡的主要类型（包括有被小泡和其它形式的小泡）及各类型膜泡的结构、运输途径与生物学功能8、2007论述1#——概述依赖泛素化的蛋白质降解途径及分子机制（参考）泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。在蛋白质的泛素化过程中，E1（ubiquitin-activatingenzyme，泛素激活酶）水解ATP获取能量，通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，然后E1将泛素交给E2（ubiquitin-conjugatingenzyme，泛素结合酶），最后在E3（ubiquitin-ligase，泛素连接酶）的作用下将泛素转移到靶蛋白上。9、2008简1#——在物质跨膜运输中，协助扩散和主动运输有何异同。10、2008简7#——G蛋白偶联受体多肽的七次跨膜结构是如何形成的？在哪里形成，又如何到达质膜上的？为什么在质膜上的N端是朝向细胞外的。G蛋白偶联受体（膜蛋白）：蛋白合成起始后转移至糙面内质网，在内质网上形成7次跨膜蛋白结构，通过COPII转运小泡转运至高尔基体进行修饰和分选，通过网格小泡转运到细胞膜表面。第六类：细胞器•1、2002简4#——假若用生物氧化抑制剂KCN处理，培养细胞会出现怎样的形态变化（线粒体）•2、2003简2#/2006简4#——植物细胞中既然有叶绿体这种产能细胞器，为什么还必须有线粒体存在？叶绿体与线粒体功能的区别•3、2003简3#——为什么凡是蛋白质合成旺盛的细胞中核仁都明显偏大核仁的功能：合成核糖体的场所，核糖体又是合成蛋白质的工具。 •4、2003简4#——核糖体的大小亚单位在蛋白质合成过程前后的装配和解离有何生物学意义核糖体的结构与功能P312•5、2003论述3#——试述植物细胞特有的结构及其功能。•6、2005简2#——用剧烈匀浆法分离获得的叶绿体，可在光诱导下产生ATP和NADPH，但不能固定CO2，试推测此状态叶绿体的结构发生了什么问题？P228（叶绿体）固定CO2是暗反应，需要一系列酶促反应，在叶绿体的基质中的完成，叶绿体破裂，回导致不能固定CO2•7、2005简4#——在某些生物发育的特定时期，一些细胞中的染色体形态会发生巨大变化，简述这些染色体的结构特点及其功能（染色体）•8、2005论述4#——概述真核生物核基因组和细胞质基因组的主要特征，以及它们在细胞功能上的协调统一（核基因组与胞质基因组）细胞质基因组P234——叶绿体和线粒体是半自主细胞器:核基因组P299•9、2006论述2#——细胞质基质中合成的某些蛋白可转移入线粒体功能部位，这一现象支持哪种关于半自主性细胞器起源的学说？为什么？（线粒体共生起源P242）•8、2007简1#——为什么真核细胞被剔除细胞核后不能长期生存，而原核细胞无细胞核却能正常生存和繁殖？（细胞核P37比较）•9、2007简2#——简述中心体的结构和功能（中心体P334）•10、2007论述2#——概述核孔复合体的结构特征及生理功能。（核孔复合体P250）第七类：癌细胞1、2002简2#/2004简4#——体外培养的癌细胞为什么能悬浮培养，而正常细胞却只能贴壁培养正常细胞的天性，它总是要固定在底物上，才开始生长，其中粘着斑的形成是细胞增殖所必需的。癌细胞就没有这些特性，癌细胞是一种变异的细胞，是产生癌症的病源，癌细胞与正常细胞不同，有无限生长、转化和转移三大特点，在体外培养时贴壁性下降，失去接触抑制，培养时对血清依赖性降低可以悬浮培养。2、2002简5#——肿瘤细胞与同类型组织正常细胞融合而成的杂交细胞，会出现什么细胞生理变化，为什么？肿瘤细胞与同类型组织正常细胞融合而成的杂交细胞，会出现下列细胞生理变化：①具有无限增殖的潜能②在体外培养时贴壁性下降③失去接触抑制④培养时对血清依赖性降低因为杂交后的细胞会具有肿瘤细胞的特性3、2006简3#——人类许多癌症患者（约30%）是与ras基因（编码Ras蛋白）突变有关，试分析其机理作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因.ras基因激活的方式有3种:基因点突变,基因大量表达,基因插入及转位.其中ras基因被激活最常见的方式就是点突变,多发生在N端第12,13和61密码子,其中又以第12密码子突变最常见,而且多为GGT突变成GTT.不同突变位点对P21的活化机制不同,第12密码子突变可以减弱P21内在的GTP酶活性,并使细胞凋亡减少,细胞间接触抑制减弱;第61密码子突变可削弱GAP对P21的内在GTP酶活性,并可减弱GAP与P21结合的稳定性.ras基因突变致癌的机制ras基因激活构成癌基因,其表达产物Ras蛋白发生构型改变,功能也随之改变,与GDP的结合能力减弱,和GTP结合后不需外界生长信号的刺激便自身活化.此时Ras蛋白内在的GTP酶活性降低,或影响了GAP的活性,使Ras蛋白和GTP解离减少,失去了GTP与GDP的有节制的调节,活化状态的Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使,造成细胞不可控制地增殖,恶变.同时细胞凋亡减少,细胞间接触抑制增强也加速了这一过程.第八类：细胞表面与细胞骨架•1、2004论述1#——在细胞与外界（基质、细胞）的接触中，涉及细胞表面哪些分子？这些分子各有什么作用？细胞表面黏着因子P95-97胞外基质P97-105•2、2005论述1#——中间纤维有哪些类型？又分别位于哪些细胞中？某学者对小鼠胚胎实施两种中间纤维A和B的基因敲除（knockout)实验，其结果是新生仔鼠瘫软少动且体表皮大面积发生水泡，请判断A和B分别是何种类型的中间纤维及其功能。中间纤维P335-336A是结蛋白纤维，位于肌细胞中B是角蛋白纤维，位于上皮细胞中•3、2007简5#——遗传病KARTAGENERS’综合症患者的气管上皮细胞外表的纤毛不能摆动，此外，其精子也不能游动。试解释此遗传病症状产生的细胞生物学机制。纤毛不能摆动，其精子也不能游动说明微管功能出现问题。P3334、2007论述4#——分别简述细胞表面黏着因子和胞外基质个包含的主要类型及其功能。细胞表面黏着因子P95-97胞外基质P97-1055、2008论述1#——试述细胞外空间的各种结构及其功能。P97-1056、2008论述3#——概述细胞识别的分子基础及细胞识别所引起的细胞效应。P95-97第九类：相关知识类1、2002简3#——医学界大力提倡母乳哺婴，请以细胞生物学知识解释此举措对母婴保健各有何好处？（参考）母乳喂养的优越性 .(一)母乳是最好的食物和饮料.1.哺喂母乳,对出生头4-6个月的婴儿来说,是最理想的营养品.母乳含有婴儿所需要的全部营养,而且搭配合理.(1)母乳中的钙,磷比例适宜,吸收,利用率高,有利于婴儿牙齿和骨骼的发育.(2)母乳中的蛋白质和脂肪颗粒小,容易被消化.(3)母乳中所含的乳糖比其他乳类多.(4)因直接喂哺,母乳中的维生素C和维生素B1等营养素不被破坏,优于喂哺其他需加热消毒的乳类.2.母乳中所含水分可满足婴儿的需要.喂母乳解饥还能解渴.(二)母乳喂养可使婴儿少得病.1.母乳含有抗体,可增强婴儿的抗病能力.特别是初乳(产后12天以内的乳汁),含有多种抗病物质,使新生儿有了抵抗病菌侵袭的"盾牌".因此,发生肺炎,腹泻等疾病的危险相应减少.初乳中还含有抑制细菌繁殖的溶菌酶,也对新生儿起着保护作用.2.健康的母亲所分泌的乳汁,干净无菌,且喂哺简便,不会受环境中病菌的污染.3.母乳喂养的婴儿不易患过敏性疾病,如婴儿湿疹.(三)母乳的成分更有利于脑的发育.1.母乳含有丰富的牛黄酸.牛黄酸是促使脑细胞发育的重要物质.2.母乳含有较多的乳糖.脑细胞需要利用乳糖所提供的热能.母乳喂养,能提供较多的热能.(四)哺婴,对母亲也有益.1.婴儿吸吮乳汁,可促使母亲子宫收缩,有利于子宫复原,减少产后出血.2.哺乳的母亲,日后患乳腺癌的几率较未哺乳的母亲低.3.哺乳,可消耗母体多余的脂肪,有利于产后体型的健美.2、2002简6#——同一个体的不同组织细胞对电离辐射的敏感性不同，这是什么原因？（细胞差异）组织细胞对放射线敏感性不同,在相同辐射剂量作用下,不同细胞产生的损伤亦不同,如脑细胞与血管内皮细胞反应不同，有些反应可发生于辐射的瞬间,有些变化则需要很长的时间。普遍认为,DNA分子是细胞内对放射线最敏感的靶分子,细胞对电离辐射反应的分子基础是DNA损伤。γ射线可引起多种类型的DNA损伤:单键断裂(SSB),双键断裂(DSB),碱基损伤等。这些损伤是射线直接作用于DNA的结果和源自细胞内水和其他分子放射性电离产生的自由基的间接作用。研究表明位于胞核周边区的DNA是放射敏感区,放射敏感性与DNA损伤的修复相关,那些没有修复的DSB是导致放射性损伤的主要原因。损伤DNA的细胞在继续执行其功能,并完成一次或几次细胞分裂后才失去存活功能。分裂进一步加剧使DNA失去功能和染色体畸变,并最终因无法保持自身结构和功能的完整性而死亡。射线不仅损伤DNA,并且干扰其复制、转录功能,干扰mRNA合成和基因表达。分裂旺盛的组织（如骨髓、皮肤）对电离辐射敏感，因为分裂细胞的DNA损伤后容易形成变异细胞或引起细胞死亡。成熟不再分裂的细胞被辐射打断DNA后，不一定影响向它的生活，因为这类细胞仅表达少量的基因（只要重要的管家基因能够工作就行）。3、2002简6#——具有融合蛋白的病毒是通过什么途径进入被感染细胞的？（参考）某些病毒囊膜蛋白在较低pH值时，具有催化膜融合的功能。病毒通过受体介导的内吞作用进入被其感染的细胞，被运送到胞内体，在胞内体酸性条件激活下，病毒囊膜融合蛋白催化病毒与胞内体膜融合，使病毒核酸进入胞质并进行复制。4、2003简5#——氯霉素等抗生素具有广谱杀菌作用，其原因是什么？（参考）抗生素的作用主要干扰病原微生物的代谢过程，从而起到抑菌或杀菌作用。抗生素的作用原理大体可概括以下方式：（1）抑制细菌细胞壁的合成（如青霉素）；（2）影响细菌细胞膜的通透性（如多粘菌素）；（3）抑制菌体蛋白质的合成（如氯霉素、四环素）；（4）抑制细菌核酸合成（如灰黄霉素）。5、2004简3#——有机磷农药的毒理机制是抑制乙酰胆碱酯酶的活性，为什么这类农药易造成人、畜中毒死亡？（参考）有机磷农药中毒的主要机理是抑制胆碱酯酶的活性。有机磷与胆碱酯酶结合，形成磷酰化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去催化乙酰胆碱水解作用，积聚的乙酰胆碱对有神经有两种作用：　　1.毒蕈碱样作用乙酰胆碱在副交感神经节后纤维支配的效应器细胞膜上与毒蕈碱型受体结合，产生副交感神经末梢兴奋的效应，表现为心脏活动抑制，支气管胃肠壁收缩，瞳孔插约肌和睫状肌收缩，呼吸道和消化道腺体分泌增多。2.烟碱样作用乙酰胆碱在交感、副交感神经节的突触后膜和神经肌肉接头的终极后膜上烟碱型受体结合，引起节后神经元和骨骼肌神经终极产生先兴奋、后抑制的效应。这种效应与烟碱相似，称烟碱样作用。乙酰胆碱对中枢神经系统的作用，主要是破坏兴奋和抑制的平衡，引起中枢神经调节功能紊乱，大量积聚主要表现为中枢神经系统抑制，可引起昏迷等症状。有机磷与胆碱酯酶结合形成的磷酰化胆碱酯酶有两种形式。一种结合不稳固，如对硫磷、内吸磷、甲拌磷等，部分可以水解复能；另一种形式结全稳固，如三甲苯磷、敌百虫、敌敌畏、对溴磷、马拉硫磷等，使被抑制的胆碱酶不能再复能，可谓胆碱酯酶老化。胆碱酯酶不能复能，可以引起迟发影响，如引起周围神经和脊髓长束的轴索变性，发生迟发性周围神经病。 6、2005简3#——为什么低血糖患者通常会发生脑供氧不足而头晕的症状？（参考）低血糖症是指血葡萄糖（简称血糖）浓度低于正常的一种临床现象，正常人无论空腹或饭后的血糖，都不会低於7Obgm/dl，成年人血糖低于2.8mmol/L(50mg/dl)时，可认为是血糖过低。由于神经组织在一般情况下几乎完全利用糖作为代谢能源，葡萄糖为脑细胞活动的主要能源，但脑细胞糖储量有限。每克脑组织约2.5~3μmol，仅能维持脑细胞活动数分钟，因此一旦发生低血糖即可有脑功能障碍，脑细胞无法进行充分的有氧呼吸，发生供氧不足而头晕。