实验八 蛋白质浓度测定

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1、实验八蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法一、目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassiebrilliantblue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白浓度的快速而灵敏的方法，于1976年由Bradford建立。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（λmax）的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋

2、白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是：⑴灵敏度高，比Lowry法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。⑵测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2min即可完成，其颜色可以在1h内保持稳定，且在5~20min之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。++2+⑶干扰物质少。

3、如干扰Lowry法的K、Na、Mg离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：⑴由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。⑵仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。三、试剂和器材⑴试剂：考马斯亮蓝G-250试剂100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mg85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。⑵标准和待测蛋白质溶液①标准蛋白质溶液。结晶牛血清蛋白，

4、预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。②待测蛋白质溶液。蛋白片溶解液。⑶器材试管1.8×18cm（×10）；试管架；移液管0.1mL（或0.2mL、0.5mL）、5mL；分光光度计。四、操作方法取10支试管，1号作空白对照，2~8号用来做标准蛋白质溶液曲线，9~10号作未知浓度样本蛋白质测定。按照下表顺序分别加入样品、NaCl和试剂（mL）。12345678910标准蛋白质溶液1mg/mL0.000.010.020.030.040.050.060.07未知蛋白质溶液0.020.04NaCl（0.15mol/mL）5.105.09

5、5.085.075.065.055.045.035.085.06考马斯亮蓝试剂5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白质量μg吸光度值A595试剂加完后摇匀，2min后开始测定595nm处的光密度值A595，1号管做空白对照。注意测定速度，要求在1h内测定完成（最好在0.5h内）。蛋白质含量计算:⑴用标准蛋白质量（μg）为横坐标，用光密度值A595为纵坐标作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测定的未知样本的A595值，即可以查出未知样本的蛋白质含量。⑵也可依据正比例关系计算：A测蛋白质含量（mg/mL）＝×C标A标五、安排与要求4人一组做1份按要求准确

6、添加试剂。下次实验请学生自带纯净水1瓶。思考题:依据所给条件和要求，选择一种常用蛋白质定量方法测定蛋白质浓度：1、测定饲料豆粕中的蛋白质百分含量。2、很迅速地测定一系列试管（20支）中溶液的蛋白质浓度。方法灵敏度时间原理干扰物质说明灵敏度低，适于费时将蛋白氮转化为非蛋白氮（可用用于标准蛋白质含凯氏定氮法0.2~1.0mg氮，8~10小氨，用酸吸收后滴三氯乙酸沉淀量的准确测定；干（Kjedahl法）误差为±2％时定蛋白质而分离）扰少；费时太长。中速硫酸铵；测定快速，但不太2＋双缩脲法灵敏度低多肽键+碱性Cu20~30分Tris缓冲液；灵敏；不同蛋白质（Biuret法）1~20mg→紫色络合物钟

7、某些氨基酸显色相似。快速蛋白质中的酪氨酸各种嘌呤和嘧用于层析柱流出液较为灵敏紫外吸收法5~10分和色氨酸残基在啶；的检测；核酸的吸50~100μg钟280nm处的光吸收各种核苷酸收可以校正。硫酸铵；耗费时间长；操作慢速双缩脲反应；磷钼Folin-酚试剂法灵敏度高Tris缓冲液；要严格计时；40~60酸-磷钨酸试剂被（Lowry法）~5μg甘氨酸；颜色深浅随不同蛋分钟Tyr和Phe还原各种硫醇白质变化。考马斯亮