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时间:2019-08-14
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1、总RNA的提取和检测实验报告 实验二总RNA的提取和检测 实验目的 1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA的方法; 2.熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法;3.掌握RNA琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA的电泳图谱; 实验原理 概述 1.10-5μgRNA/细胞含有rRNA80-85%:28S18S5S tRNA,snRNA10-15% mRNA1-5% 2.mRNA3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构,可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 分离的方法:异硫氰酸胍氯化铯超速离心
2、法,盐酸胍-有机溶剂法,氯化锂-尿素法,蛋白酶K-细胞质RNA提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。4.目前常用的是Trizol法。Trizol的主要成分 是一种新型总RNA抽提试剂,主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,其主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 2.酚虽可有效的变性蛋白质,但是它不能完全抑制RNA酶活性,因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相
3、,RNA在上层水相中。 4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA。(三)总RNA的纯度检测原理: 不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收,光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA在260nm紫外光波长处有最大的吸收峰。 因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/mL的单链RNA。用PH=的TE稀释RNA样品n倍并以TE为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/mL)=40×OD260读数×稀释倍数(n)
4、/1000 实验步骤 样品处理与Trizol用量 1.提取组织RNA时,每50~100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解; 2.悬浮细胞先离心沉淀,每5-10×106个细胞加1mLTrizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。 3.培养贴壁细胞不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/mL比例加入。(注意:匀浆一定要彻底,是提取高质量RNA的前提;细胞数量与Trizol的比例,细胞的数量不能过多。)操作步骤 1.细胞中加入1mLTrizol用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后,室温
5、放置5min,使其充分裂解。 2.按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置2-3min。(注意:此步一定要振荡混匀,使氯仿和Trizol不分层) 3.4℃12,000g离心5-10min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用Trizol试剂的60%。 4.吸取上层水相,至另一新的离心管中。一般400-450μL就足够了,千万不要贪多! 5.加入与水相等体积异丙醇后,上下颠倒混匀,4℃放置5min。 ℃12,000g离心10min,弃上清,离心后在
6、管侧和管底出现胶状沉淀。8.加入1mL75%乙醇,盖紧盖子后,温和转离心管1周,充分润洗管壁。℃12,000g离心5min,尽量弃上清。 10..室温晾干或真空干燥5min。 11.加入适量冰冷无RNase的PEPC水,充分震荡混匀,瞬时离心,备用。检测步骤 1.将提取的RNA,按1:20加入TE进行稀释 2.稀释过后用分光光度仪进行检测,先使用TE行进校对,空白对照,所有样品要先润洗三次之后,再加入50μL样液进行检测 3.可直接显示260nm下的OD值以及,260/280的对比结果 4.再将剩余未稀释的RNA提取液,进行
7、琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性 结果与分析
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