课用肝糖原的提取与

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1、实验四肝糖原的提取与鉴定刘曼TEL：15201429769E-mail：manna_liu@126.com实验报告问题：字如其人结果无分析照抄糖原的结构特点糖原是一种高分子化合物(分子量约为400万)。微溶于水，无还原性，与碘作用生成红色。1.葡萄糖单元以α-1,4-糖苷键形成长链。2.约10个葡萄糖单元处形成分枝，分枝处葡萄糖以α-1,6-糖苷键连接，分支增加，溶解度增加。实验原理肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一，储存量虽然不多，但在代谢过程中，它是维持血糖平衡及体内糖的重要来源之一，其合成或分解，对血糖浓度的调节起着重要的作用。肝脏蛋白质(沉淀)糖原(上

2、清)糖原沉淀与碘液反应斑氏试剂三氯乙酸95%乙醇，离心HCl水解加H2O溶解肝糖原：棕红色砖红色沉淀实验试剂10％（w/v）三氯乙酸溶液1５％（w/v）三氯乙酸溶液295％（v/v）乙醇3浓盐酸4实验试剂20%（w/v）NaOH溶液1碘液2斑氏试剂3实验器材洗净的石英砂1研钵2离心机3电磁炉4实验步骤一、肝糖原的提取1称取肝组织2g（两个组用），置研钵中。加入洗净的石英砂少许及10％三氯醋酸2ml，然后研磨。2再加5％三氯乙酸4ml，继续研磨，至肝脏组织已充分磨成肉糜状为止。然后以2500r／min离心10min。3将上清液转入另一离心管中，测量其体积。4加入

3、等体积的95％乙醇。混匀后，静置10min，此时可见糖原呈絮状析出。5将此混合物以2500r／min离心10min。弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上1～2min。6向沉淀内加入蒸馏水2ml，再用玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即得糖原溶液。（分两份）实验步骤二、肝糖原的鉴定1糖原的颜色反应：在白瓷盘的两个凹槽内，一个滴加3滴肝糖原溶液，一个滴加3滴蒸馏水。2在两个凹槽内各加1滴I2-KI溶液，在桌面上来回晃动白瓷盘。3比较两凹槽内溶液颜色有何不同，并解释之。2取出冷却，然后以20％NaOH溶液中和至中性(用pH试纸检验，加入约3滴)。3在上述溶液内，加入斑氏试剂2ml

4、。再将该试管置沸水浴加热5min，取出冷却。观察沉淀的生成，并解释之。1肝糖原水解实验：将剩余的糖原溶液转入1支试管内，加入浓盐酸3滴后，将之放在沸水浴中加热10min。注意事项取肝脏组织时，吸去其附着血液，因血液可能含还原性葡萄糖，会影响后面糖原的鉴定。研磨应充分，使细胞破裂，肝糖原释放出来。研磨不充分会得不到糖原或含量很少，影响后面的鉴定。研磨后匀浆转入离心管离心可用滴管转移，如果采用倒入，不能洒落管外，应尽量转移干净。离心时与另一组的离心管平衡，对称放入离心机。上清液加入95％乙醇后，注意混匀，防止分层，可用滴管吹吸混匀，或玻璃棒搅拌混匀。调节pH，必须

5、调至中性。糖原会在浓盐酸在沸水浴下分解成小分子化合物，其中有还原性的麦芽糖和葡萄糖。还原性糖会在碱性条件下，班氏试剂与其在沸水浴下生成砖红色Co2O沉淀。班氏试剂为碱性溶液，所以须用20%NaOH溶液中和至中性。过酸，Cu2+会变得较为稳定，不容易发生反应，所以不能进行试验。如果溶液中还原糖含量较低，产生的氧化亚铜便会相应减少，因此试验后可能只会出现绿色、混浊的黄色或橙色沉淀物。班氏试剂中有CuSO4，NaCO3和柠檬酸钠。CO32-提供碱性环境，柠檬酸钠为络合物，帮助Cu2+与葡萄糖反应，沸水浴下，Cu2+变为Cu+，即Cu2O，Cu2O为砖红色沉淀。葡萄糖

6、被氧化为糖酸，麦芽糖亦如此。糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4十2NaOH═Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2十C6H12O6═2Cu

7、OH十氧化型葡萄糖+H2O2CuOH═Cu2O↓(红色)+H2OCu(OH)2═CuO↓(黑色)+H2O提取糖原时，首先将新鲜的肝组织与石英砂及三氯乙酸共同研磨。这样当肝组织被充分破碎后，其中的蛋白质会被三氯乙酸所沉淀。而糖原仍留在溶液中。然后离心除去沉淀，滤液中的肝糖原可通过加入乙醇而沉淀下来。将乙醇沉淀的糖原溶于水，一部分用做碘的颜色反应，另一部分经酸水解成葡萄糖后，用斑氏试剂进行检验。糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，2030个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较

8、长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残