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时间:2019-11-09
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1、肝糖原的提取、鉴定与定量实验目的1.掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。3.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4.熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况,采用合适的混匀方法)。5.正确掌握溶液转移的操作。6.正确操作使用分光光度计。实验原理(一)肝糖原的提取、鉴定糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95
2、%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。实验原理(二)肝糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。CuSO4+2NaOH═Na2SO4+Cu(OH)2↓2Cu(OH)2+C6H12O6═2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O2CuOH═Cu2O↓(红色)+H2OCu(OH)2═CuO↓(黑色)+H2O△(三)肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱
3、水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)mg范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。实验原理实验材料(一)仪器1.普通离心机,室温~100℃恒温水浴箱(×2),722型分光光度计,精度为10mg级电子天平(×1)2.剪刀(×1),镊子(×1),研钵(×1)3.试管架(×1),10mL离心管(×2),(100×15)mm试管(×6)4.刻
4、度吸量管(2mL×1,5mL×2),1000μL微量可调取液器(×1)5.100mL容量瓶(×1)6.白瓷反应板(×1)实验材料(二)试剂1.鸡肝。2.95%乙醇。3.0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液:称取未潮解的三氯醋酸(C2HCl3O2,163.39)5g,加蒸馏水溶解至100mL。4.0.15mol/LNaCl溶液:称取8.8gNaCl加蒸馏水溶解至1000mL。5.12mol/LHCl:浓HCl原液(36%~38%)。6.12.5mol/L(50%)NaOH:称取NaOH50g,用蒸馏水溶解至100mL。7.碘试剂:碘l00mg和K1200mg溶于50mL蒸馏水
5、中。实验材料8.班氏试剂:称取柠檬酸钠(C5H5Na3O7·5H2O,294.10)17.3g和无水碳酸钠(Na2C03,105.99)100g溶于蒸馏水700mL中,加热促溶。冷却,慢慢倾人17.3%硫酸铜(CuSO4·5H2O,249.68)l00mL,边加边摇。再加蒸馏水至1000mL,混匀,如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。9.5.35mol/L(30%)KOH溶液:称取KOH30g,加蒸馏水溶解至100mL。11.标准葡萄糖液(50mg/L):称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg,加蒸馏水溶解至500mL。12.17mol/L(90%)H2SO4:量取蒸馏水30m
6、L,加浓H2SO4500mL。13.蒽酮显色剂:称取蒽酮0.20g,用17mol/LH2SO4溶解至100mL。此试剂不稳定,以当日配制为宜,冰箱保存可用4~5天。操作步骤(一)肝糖原的提取操作步骤注意事项1肝糖原提取一步,向上清液中加人等量的95%乙醇后,务必注意混匀。由于上清液为水溶液,比重大于95%乙醇,溶液分成两层。加之上清液已4mL多,加上等量乙醇,总量接近9mL,混匀操作比较困难,最好用倾倒混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。2糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色,2030个之间使碘呈现紫色,60个以上的会使碘
7、呈现蓝色。淀粉中分枝链较长,故呈蓝色,而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下(通常812个葡萄糖残基),吸附碘后呈现红棕色。3糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步,加班氏试剂不能过量,否则反应液呈黑色浑浊,观察不到应有的结果。操作步骤(二)肝糖原定量测定操作步骤操作步骤
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