级硕士高级免疫学实验技术-W

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1、高级免疫学实验技术2012级硕士研究生吉林大学白求恩医学院免疫学系免疫印迹WesternblottingWesternblotting是一种在固相膜上如硝酸纤维素(NC)膜进行的抗原抗体反应。蛋白质经过电流作用后，可以从胶转移至膜上，再与特异性抗体孵育，洗去游离的抗体，然后和酶标记的二抗孵育，再进行底物显色。由于抗原抗体反应特异性好，亲合力高，Westernblotting检测的灵敏度较高。物品准备试剂分配：1套/室器材、仪器：1套/室丙烯酰胺(ACR)待测蛋白(OVA)塑料盒加样器头电泳仪TEMED考马斯亮兰染液手套加样器电泳槽浓缩胶缓冲液封闭液(3%

2、BSA)封口胶条小烧杯半干式电转印仪分离胶缓冲液上样缓冲液夹子刀片硝酸纤维素膜AP(fresh)一抗(兔抗OVA抗体)梳齿玻璃板蒸馏水二抗(HRP-DaR)平头镊子5ml吸管电泳缓冲液洗液滤纸条吸水滤纸转移缓冲液实验步骤SDS-PAGEProteinBlottingImmuno-Detection实验步骤SDS-PAGEProteinBlottingImmuno-DetectionSDS-PAGE实验步骤组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O封盖，在室温下聚胶30min。倒掉dH2O，且dH2O冲

3、洗，然后用滤纸片将水吸干。加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液。平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。Start胶的配制：分离胶浓缩胶dH2O1.3ml0.9ml30%丙烯酰胺2.5ml

4、0.45ml分离胶缓冲液(SDS)3.75ml---浓缩胶缓冲液(SDS)---1.25ml2.4%过硫酸胺(AP)375l250lTEMED10l10l制胶注意丙烯酰胺凝胶用过硫酸铵（Ap）聚合后，TEMED（四甲基乙二胺）加速催化Ap自由基的释放，加速胶的聚合，所以准备工作做好后再加TEMED。注意操作过程中不要混入气泡，否则容易影响电泳时电流的通过。影响蛋白质迁移的速率。用玻璃板制板时夹夹子对称，稍微靠下，以免夹碎玻璃板。胶的配制：分离胶浓缩胶dH2O1.3ml0.9ml30%丙烯酰胺2.5ml0.45ml分离胶缓冲液(SDS)3.75ml

5、---浓缩胶缓冲液(SDS)---1.25ml2.4%过硫酸胺(AP)375l250lTEMED10l10l灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O封盖，在室温下聚胶30min。MSample+-浓缩胶分离胶SDS-PAGE实验步骤组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O封盖，在室温下聚胶30min。倒掉dH2O，且dH2O冲洗，然后用滤纸片将水吸干。加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。装入电泳槽，

6、固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液。平稳拔下梳子,内槽液体量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品，30l/well。接通电源，200V(恒压)进行电泳，当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时，终止电泳。小心将胶取下，注意不要将胶破坏，准备转膜。Start蛋白变性不同的蛋白带有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与还原剂(低分子量的硫醇-2-ME/DTT)并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上，不同蛋

7、白质的迁移率仅取决于分子量。上样缓冲液包括：SDS----负电荷溴酚兰----指示剂甘油----下沉二巯基乙醇----解链使蛋白质成线性Tris—HCL----缓冲液SDS-PAGE实验步骤组装两块玻璃板，配制分离胶。(见后)。灌胶：先灌分离胶，胶量大约在梳子下1cm处，缓缓加dH2O封盖，在室温下聚胶30min。倒掉dH2O，且dH2O冲洗，然后用滤纸片将水吸干。加入新配制的浓缩胶，胶量距离上边0.4cm处，倾斜插入梳子，避免产生气泡，然后补齐浓缩胶，室温下聚合30min。装入电泳槽，固定好胶，每个电泳槽放一块胶,倒入电泳缓冲液。平稳拔下梳子,内槽液体

8、量要刚好没过样品孔，外槽的液体量要低于内槽。用电泳缓冲液冲洗样品孔，用微量加样器