毕赤酵母的基因表达及其初步纯化

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1、4Aβ15基因在毕赤氏酵母中的分泌表达及初步纯化——Alade毕赤氏酵母作为表达载体的优点1、表达效率高，遗传稳定性好2、结构简单，表达调控机理比较清楚3、有Pr加工系统4、培养简单，成本低廉5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的分泌却很少，利于下游的纯化（毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达系统。）一、实验材料DH5α、pPICZαA、GS115、TOP10、，pQE4Aβ15pMD18T载体、Pfu高保真酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶.PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、羊抗鼠IgG-HRP、增强型

2、HRP-DAB、底物显色试剂盒.基因在毕赤氏酵母中表达的简单过程4Aβ15基因的获取(PCR)↓目的基因的修饰与克隆↓表达载体的构建↓毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定↓目的基因在毕赤酵母GS115中的表达↓重组蛋白的鉴定与分析↓重组4A15的初步纯化1、目的基因4Aβ15获取----PCR在设计N端引物时引入XhoⅠ酶切位点及Kex2信号肽水解位点，并删除Kex2后面的Ste3位点（Glu-Ala-Glu-Ala）在下游引物（5GCTCTAGATTGATGATGAACTTCATA3）引入终止密码子和XbaⅠ酶切位

3、点，目的基因4Aβ15获取----PCR以pQE4Aβ15为模板，进行PCR扩增，扩增条件为94℃3min，94℃30s，57℃30s，72℃50s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存.1.5%琼脂糖分析PCR产物2、目的基因的修饰与克隆PCR扩增产物回收后+克隆载体pMD18T以1：3（V）的比例通过T4连接酶接，连接产物转入大肠杆菌DH5α，菌落PCR。分析阳性菌落：挑取4个阳性菌落进行序列分析.序列正确的命名为p4Aβ153、表达载体的构建双酶切基因片段p4Aβ15，用试剂盒回收，双酶切质质粒pPI

4、CZaA，回收大片段，定向连接，连接产物在低盐的LB平板上培养。挑取抗性菌落提取质粒，进行双酶切鉴定。5、毕赤氏酵母GS115的电转化与鉴定——5.1电转化1、线性化——限制性内切酶BstXI单酶切表达载体和重组质粒2、电转化——电激转化毕赤酵母GSll5感受态细胞（转化条件：电压1500V，4ms）.电转化完成后培养转化物涂布于Zeocin100mg/L的YPD平板上，28℃恒温培养36h左右，抗性平板上生长的菌落相应的命名GS115/pPICZaA和GS115/pPICZa4Aβ15.5、毕赤氏酵母GS115

5、的电转化与鉴定——5.2转化子的鉴定提取抗性菌落的基因组DNA,(方法参见Invitrogen酵母手册).以此基因组DNA为模板，pPICZaA5Aox1primer和3Aox1primer为引物进行PCR.1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析6、目的基因在毕赤酵母GS115中表达挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素……）的培养基上摇床培养（28℃，250r/min培养至OD600为2~6）离心收集菌体，用BMMY重悬，至OD600≈1继续摇床。.每24h向培养基中添加无水甲醇（诱导表达产物分泌到培养基

6、中）至终浓度为1%；每24h取样，离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后进行12%SDS-PAGE分析.对GS115和GS115/pPICZaA作同样的处理，以便于下游SDSPAGE的分析6、重组蛋白的鉴定与分析——6.1Westernblotting将丙酮沉淀后上清→12%聚丙烯酰凝胶电泳→转移至硝酸纤维膜→1%BSA封闭硝酸纤维膜→依次加入一抗（Aβ42抗体）和二抗（羊抗小鼠HRP标记IgG），TBST洗涤5次，HRP-DAB底物显色试剂盒显色.WesternBlot原理aWesternBlot与Southern

7、印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。WesternBlot原理b经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。WesternBlot原理c以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的

8、蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot操作步骤1、蛋白样品制备2、蛋白含量的测定3、SDS－PAGE电泳4、转膜5、免疫反应6、化学发光，显影，定影7、凝胶图象分析6、重组蛋白的鉴定与分析6.2质谱分析从考染（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白带，进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析.7、重