分子生物学实验课考试资料整理

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1、分子考试资料整理1.质粒DNA的构型与电泳速率的关系？答：DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型而形成的分子筛效应。①在相同的构型下，DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。②相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。当琼脂糖凝胶的浓度较低时，电泳速率为：超螺旋DNA>线性DNA＞开环DNA。2.碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？①基本原理质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA

2、拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。②三种溶液的作用（溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0

3、；溶液II，0.2NNaOH/1%SDS(新鲜的)；溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸。）溶液I:Tris-Cl:适当pH值,葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解,悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生长(是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂)溶液II：NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂。这一步要记住两点：第一，不能用旧的NaOH；第二，时间不能过长，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。SDS:是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜

4、上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。溶液III：醋酸钾:K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；高浓度的盐，使得沉淀更完全（在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀）。2M的醋酸:中和NaOH，创造质粒复性的环境。3.感受态细胞制备过程应注意的问

5、题；①细胞的生长状态和密度最好从-70℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600（0.4-0.5）控制。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同；受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。②质粒DNA的质量和浓度一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大

6、的转化效率低；重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。③整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌。④用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染⑤整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴⑥CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。⑦化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；4.挖胶过程应注意什么？①保证切下的条带没有外源DN

7、A的污染。②切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积。③切胶时尽量在长波长下进行，减少紫外对DNA的损伤。④为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，可采用薄而宽的梳子来跑胶。5.如何灭活RNase？A.RNase灭活剂①焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。②异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。③氧钒核糖核苷复

8、合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。④RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合