《细胞工程基本技术》PPT课件

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1、第三章细胞工程基本技术一、细胞工程实验室的设置1动物细胞工程实验室的设置无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间培养观察室制备室储藏室清洗与灭菌室2植物细胞工程实验室的设置除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等。二、常用仪器与设备超净工作台倒置显微镜和相差显微镜干燥箱水纯化装置冰箱（4℃、-20℃、-70℃）压力蒸汽消毒器细胞记数板和电子细胞记数仪过滤除菌装置离心机移液管、吸管离心管移液器天平动物细胞工程实验室基本设备仪器1培养箱二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（5%）以稳定pH值，温度：哺乳类35

2、℃-37℃，鸟类38.5℃，气相：O2、CO2、pH7.2-7.42显微操作仪3细胞融合仪4细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐-196℃）5培养用器皿各种培养瓶、培养皿、多孔培养板（6、24、96）6手术器械等植物细胞工程实验室基本设备仪器光照培养箱人工气候室摇床培养瓶三、实验室的生物安全根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级,即:P1、P2、P3、P4（protect）一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是：1、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着

3、专门实验服；6、处理细胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。四、培养用品的清洗在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分(有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。1、玻璃用品的清洗在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、

4、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。①浸泡初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。培养后的玻璃器皿多附有大量蛋白质，用完后应立即初步刷洗，浸泡在蒸馏水中，注意让水完全进入瓶皿中，不要留有气泡。使用新的器皿应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸(5％)浸泡过夜或煮沸30分钟，中和其中的碱性物质后再清洗。②刷洗浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。③浸酸刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。清洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分有效，是清洗过程中关键环节。清洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比

5、例配制而成。浸泡时器皿要充满洗液，不留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面三种：强液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml次强液：重铬酸钾120g，浓硫酸200ml，蒸馏水1000ml弱液：重铬酸钾l00g，浓硫酸l00ml，蒸馏水1000ml配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸。新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置。也可以使用10％～40％的硝酸溶液。④冲洗玻璃器皿浸酸后必须用流

6、水充分冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，必须重复十次以上，不留任何残迹。最后用蒸馏水漂洗2~3次，用双蒸水漂洗1次，烤干备用。玻璃滤器原则上与玻璃器皿清洗相同。无论是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法。2、橡塞清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗。胶塞类橡胶用品，每次用后先用蒸馏水浸泡，然后用2％NaOH煮沸10-20min，用自来水冲洗干净，再用1％稀盐酸浸泡30min，用自来水冲洗、蒸馏水漂洗2-3次，最后双蒸或三蒸水漂洗1次，晾干后备用。3、塑料器皿的清洗细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这

7、些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残留附着物，用2％NaOH浸泡过夜，流水冲净后再用5％盐酸浸泡30min，自来水冲洗、蒸馏水漂洗2~3次，最后三蒸水漂洗2次，晾干备用。五、消毒灭菌防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法。总的来说有物理方法和化学方法两大类。物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。（一）物理灭菌法1、紫外

8、线消毒常用来消毒空气，操作表面和一些不能用其它方法消毒的物品(如塑料培养皿等)。一般距紫外灯2.5米范围内直接照射20分钟即可。２、电离辐射消毒适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。３、湿热灭菌湿热灭菌即高压蒸气灭菌