实验三_葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质

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1、实验二、葡聚糖凝胶柱层析1、目的与要求：1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；1.2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层　　　析的操作技术。2、概述及原理：凝胶是一类不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）。2.1、能用于层析的凝胶主要有下面几种：目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚

2、糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE-Sephadex）等种类。交联葡聚糖凝胶：是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，商品名称：Sephadex。其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维空间网状结构2.2、不同型号的葡聚糖凝胶(Sephadex)的选用原则：组别分离时，SephadexG－25最为常用。例如样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐；分级分离时（如多蛋白质组分样品的分离纯化），应根据待分离样品中各组

3、分的分子量大小和分子量分布范围来确定型号。2.3、凝胶层析法的原理：凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。层析柱的重要参数：Vt(totalvolume)Vo(outervolume)Vi(innervolume)Ve(elutionvolume)Vg(gelvolume)Vt=Vo+Vi+Vg,Ve=Vo+Kd×Vi。

4、组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的体积很少时（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。②当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。③当样品体积很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率，是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无关。Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi几个特征Kd值意义：①Kd=0,则Ve=V

5、o，全排阻；②Kd=1,则Ve=Vo+Vi,全掺入；③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi，部分掺入；④Kd>1，则Ve>Vo+Vi，如某些芳香族化　　　　　合物（Phe,Tyr,Trp等），SephadexG-25对它们有吸附作用。2.4、影响凝胶层析分离的因素：2.4.1、样品的体积、粘度；2.4.2、层析柱；2.4.3、洗脱液流速的影响；2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响。2.4.1、样品的体积、粘度：分析分离时，Vsample=1-4%Vbed；制备分离时，Vsample=10-30Vbed.

6、相对粘度样品液粘度与洗脱液粘度的比值。分离效果只与相对粘度有关，一般来说，相对粘度不得超过1.5―2。今天的上样量（0.4ml）约为1%柱床体积。2.4.2、层析柱：①柱长：组别分离时，20－30厘米；分级分离时，可长至100厘米；②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱盐)，20:1─100:1(纯化)。今天选用的是1cm×30cm的层析柱。2.4.3、洗脱液流速的影响：洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。流速过快，会使色谱峰变形，流速过慢，样品扩散倾向加剧。一般流速控制在30－200ml/h。今天洗

7、脱流速控制在1ml/min。2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响：纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和消除凝胶的吸附作用；酸性组分应选用偏碱性洗脱液；碱性组分应选用偏酸性洗脱液。2.5、凝胶层析法的应用：1、生物分子的分离提纯；2、测定高分子物质的分子量；3、脱盐工具；4、高分子溶液的浓缩；5、用于去除热原物质。2.6、凝胶的防腐、保存：Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质，易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中加入抑菌剂，使用时再除去。常用0.02

8、％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。1厘米光程时，254nm处透光率为60％，280nm处透光率为100％。3、试剂、器材：3.1、层析介质SephadexG-50；3.2、样品（包含三个组分）：①蓝色葡聚糖2000，②溶菌酶，③Trp上样量：0.4ml/柱。3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水。3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪。4、实验操作过程：4.1、凝胶的溶胀4.2