《基因克隆的载体》PPT课件

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1、基因工程张锐第二节基因克隆的载体载体的概念及特点质粒载体（plasimidvectors）噬菌体载体（phagevectors）柯斯质粒载体（cosmidvectors）引言载体（vector）：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；具备多克隆位点（MultipleCloneSites，MCS），而且可携带外源DNA片段的长度范围较宽;自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作

2、和DNA的制备。具有较好的安全性，不能任意转移。载体的分类根据载体工作方式的不同可分为质粒载体（plasimidvectors）、噬菌体载体（phagevectors）、噬菌体-质粒杂合载体（考斯质粒）质粒的概念：质粒是一种广泛存在于细菌细胞中独立于染色体以外的能自主的复制的裸露的遗传物质。大多数质粒是闭合环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒。一质粒载体（plasimidvectors）质粒的特点（1）自主复制性。质粒含有自己的复制起始位点（Origin,简称ori）

3、，有些质粒具有独立的复制子结构（Replicon），因此，质粒DNA可以自主复制，形成少则几个多则成百上千个拷贝。（2）可扩增性。在格兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种复制形式，即严紧型（Stringent）和松弛型（Relaxed）。质粒的复制类型：一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。根据拷贝数的多少将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stringentplasmid）,拷贝数为1-5；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为6-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主

4、细胞间也可能有很大的变化。严紧型质粒（Stringent）：这类质粒的复制由细胞内DNA聚合酶Ⅲ介导，并被质粒上编码的蛋白因子正调控，由于这些蛋白因子极不稳定使得每个细胞只能复制少数几个质粒拷贝，一般把一个细胞内拷贝数少于5个的质粒称为严紧型质粒。松弛型质粒（Relaxed）：这类质粒的复制需要半衰期较长的DNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶及其他复制辅助蛋白因子，这类质粒在宿主细胞中一般可达到30~50个拷贝，所以称为松弛型质粒。质粒的氯霉素扩增：当宿主细胞进入生长后期，加入氯霉素可以抑制宿主细胞蛋白质的生物合成，阻断

5、宿主菌的大部分代谢途径，松弛型质粒就能利用丰富的原料及能量进行复制，最终每个细胞就能累积上千个DNA分子，把这种操作称为质粒的氯霉素扩增。（3）可转移性。在移动基因mob、转移基因tra、顺式作用元件bom等因子的作用下，许多野生型质粒可以通过细胞的接合（conjugation）作用从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞中。（4）不相容性。具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定的存在于同一个受体细胞的现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。细胞分裂理想质粒的改造与构建（1）删除不必要

6、的DNA区域。尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源DNA的装载量；一般大于20Kb的质粒转化率很低而且不稳定。（2）灭活某些质粒的编码基因。如灭活编码质粒转移的mob基因以提高质粒的安全性，灭活对质粒的复制产生负调控的基因，以提高质粒的拷贝数。（3）加入易于识别的选择标记基因。选择标记基因：在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的细胞（菌）。常用的抗生素抗性基因有：Ampr(氨苄青霉素抗性基因)、Kanr(卡那霉素抗性基因)、Tetr(四环素抗性基因)

7、、Cmr或cat(氯霉素抗性基因)、Neor(新霉素抗性基因)；LacZ△M15缺失第11-41位的氨基酸LacZ’N端140个氨基酸LacZ′MCS140个氨基酸+MCSLacZ1024个氨基酸LacZ△M15F质粒载体LacZE.coliLacZ△M15+LacZ′X-galLacZ△M15+LacZ′ΩDNAX-gal筛选标记基因：α-互补大肠杆菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将缺失了第11-41位氨基酸的编码

8、片段的LacZ△M15构建在F质粒上先转入大肠杆菌中，而将编码该酶N端140个氨基酸的-片段的LacZ′基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中。当含有LacZ′基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为是-互补（alpha-complementation）.将这