《医学微生物学》PPT课件

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1、找答案？核酸分离纯化的原则是什么？为防止核酸降解需要注意什么？核酸制备基本步骤？如何鉴定核酸浓度和纯度？核酸的保存方法有哪些？核酸的分离和纯化1前言核酸（nucleicacid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。2核酸的分类：DNA核内染色体DNA。核外也有少量DNA，如线粒体DNA，叶绿体DNA。质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。3主要内容1.核酸分离与纯化的原

2、则及要求2.核酸制备的基本步骤3.核酸的鉴定和保存4.核酸提取方法简介41.核酸分离与纯化的原则及要求1.1核酸分离与纯化的一般原则(1)保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构和功能研究的最基本要求。(2)排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。51.2核酸分离与纯化的要求(1)为保证核酸的完整性，（防止降解），在实验中应注意：尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。化学因素？生物因素？物理因素？6防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）。所用器械和一些试剂需高压灭菌，提

3、取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为0~4℃。DNA酶需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂SDS。RNA酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180℃干烤8h。7减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。高温，如长时间的煮沸。8(2)核酸纯度的要求：非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类

4、分子；排除其它核酸分子的污染，如制备RNA时，DNA分子是污染物；去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。92.核酸制备的基本步骤破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中102.1破碎细胞(1)玻璃匀浆器匀浆(2)液氮研磨法富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴；富含胶原蛋白的皮肤、肌腱；坚硬的组织如骨骼。(3)高速组织捣碎机捣碎(4)超声波处理法(5)化学处理法(SDS、吐温80等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）1

5、12.2核酸分离，去除蛋白核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。（1）加入SDSSDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；（2）加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；12（3）酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的

6、作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。13(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意142.3沉淀核酸重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸的作用；去除溶液中某些盐离子与杂质；改变核酸的溶解缓冲液。DNA纯化柱核酸提取（离心柱型）利用硅胶膜

7、特异吸附核酸15Na+Mg2+Li+2.3.1核酸的有机溶液沉淀法当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态。钾、钠、镁、锂及铵根等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA分子聚结在一起而不溶于许多有机溶剂。16核酸沉淀的盐类及浓度盐贮存液浓度（mol/L)终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.817乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇

8、优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。常用的有机沉淀剂18聚乙二醇（PEG）优点：可用