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时间:2019-07-02
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1、分子克隆技术分子克隆(molecularcloning)又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术克隆(Clone)指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆指按照人的意愿,在体外将某种生物的DNA片断插入到载体(质粒、病毒等)中,形成遗传物质的新组合---重组DNA分子(重组子),然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达,即对DNA分子进行克隆,以获得该DNA分子的大量拷贝。基本原理:将编码某一多肽或蛋白质的基因(外源基因)组装到细菌质粒(质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子)中,再将重组质粒
2、转入大肠杆菌,这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制,从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。Asaresultofthiswork,PaulBergsharedthe1980NobelPrizeinChemistrywithWalterGilbertandFrederickSanger"forfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA."AtStanfordBergandhiscoll
3、eaguessplicedtwoDNAmoleculestogetherinvitroandwereabletoinsertasetofthreegenesresponsibleformetabolizinggalactoseinEscherichiacoliintotheSV40DNAgenome.ThisworkledtotheemergenceofrecombinantDNAtechnologyandprovidedamajortoolforanalyzingmammaliangenestructureandfuncti
4、on.大肠杆菌转化体系的建立:感受态菌制备经氯化钙处理的大肠杆菌能够摄取质粒DNA。1.双抗性(TerKar)重组质粒DNA及双抗性转化大肠杆菌细胞的获得。2.真核动物非洲爪蟾的基因在原核细胞中转录意义:1.解决了无复制能力的DNA片断在宿主细胞中进行繁殖克隆的关键问题;2.质粒分子可作为基因克隆的载体将外源DNA分子导入宿主细胞;3.真核细胞的基因可被转移到原核细胞中进行克隆及表达。分子克隆中的关键技术:DNA分子的分离和富集技术;DNA分子的切割与连接技术;载体构建技术;大肠杆菌转化技术;重组DNA分子的筛选和鉴定技术分子
5、克隆的基本步骤:1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆5.克隆基因、克隆基因的表达载体特征:1.能自主复制的复制子2.可供筛选的遗传标记3.适当大小的分子量4.合适的限制性内切酶位点,方便外源基因的插入5.在受体细胞中高效复制TA克隆的idea最初来自1994年。几位学者发现TaqDNA聚合酶在PCR产物的3`末端加上一个脱氧腺苷(A),而且这种特性与模板无关。之后,invitrogen公司发明了TA克隆技术,并拥有全球TAcloning商标的专利权。线
6、性化的T载体在3`末端拥有一个脱氧胸苷(T),与PCR产物的A尾巴互补。工具酶筛选标记抗生素抗性筛选蓝白筛选:lacZ基因β-半乳糖苷酶α互补
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