第九章 分子克隆技术ppt课件.ppt

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1、第九章分子克隆技术—（1）工具酶和载体（一）分子克隆（molecularclone）在分子水平上，使一个独特的DNA序列在细胞中进行复制和表达。克隆的概念：作名词用作动词用遗传相似的群体无性繁殖分子克隆的概念：分子克隆同义概念：DNA重组技术(recombinantDNAtechnique)基因克隆（genecloning）基因操作（genemanipulation）基因工程（geneengineering）遗传工程（geneticengineering）分子克隆过程：将生物某个有利基因从其基因组中取下来，与另一个载体DN

2、A缝合成为重组DNA。然后，把这个重组DNA安置到一个受体细胞中，使其安家落户。这个基因在载体DNA的带动之下，繁衍生息，生产出需要的基因工程产品。PCRamplificationofyourinterestedgenefromagenome(insert)Plasmidpreparation(vector)Restrictiondigestion(trimmingtheDNAends)Ligation(jointheinsertandthevector)Transformation(introducetheplasmid

3、sintohostcells)AssayoftherecombinantsDNACloning:asimplifiedflowchartGenomicfragments分子克隆的特点：1.打破物种界限，不同种类生物的遗传物质组合在一起2.可以定向的改变生物的遗传特性3.增加目的基因的剂量（二）基因工程的工具酶“手术刀”专司切割之职“缝纫针”具有连接之功“复印机”行使复制之责“搬运工”胸藏末端转移之方内切酶连接酶聚合酶转移酶限制性核酸内切酶ⅠⅡⅢⅡ型限制性核酸内切酶：识别与切割DNA链上同一特异性核苷酸序列；识别序列具180

4、℃旋转序列（回文序列）；识别序列一般是4－8个碱基（4个以下很少）。对双链DNA同时切割，产生不同的切口:1）形成平头末端（bluntingends）2）形成5ˊ粘性末端（Cohesiveends）3）形成3ˊ粘性末端5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’5’-CCC-OH3’-GGG-pp-GGG-3’OH-CCC-5’+SmaI5ˊ粘性末端3ˊ粘性末端平末端同裂酶（isoschizomers)来源不同，但识别同样的核苷酸靶序列；产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶（isocandamers)来源不同，识别不

5、同核苷酸靶序列；但形成同样的末端。核酸内切酶的命名法（SmithH.O&NathansD.1973）1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophiusinfluenzae）用Hin表示用一个写在右方的字母代表菌株或型,如EcoR如一种寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系,以罗马数字表示。如大肠杆菌分别表示EcoRI,EcoRII核酸外切酶从DNA链的一头开始按序催化降解核苷酸的酶。按3‘-5’方向催化单

6、链或双链DNA，自3‘-OH末端释放5’-单核苷酸。应用：通过3‘-5’活性使双链DNA分子产生出单链区，可作为DNA标记的引物，制备特异放射性探针。DNA连接酶催化两条DNA单链相邻碱基之间形成磷酸二酯键。封闭DNA之间的缺口（nick），即双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸间失去一个磷酸二酯键出现的单链断裂；不能封闭裂口（gap），即双链DNA的某一链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组DNA分子。粘性末端DNA片段的连接：容易平末端DNA片段的连接：比较困难作用

7、:DNA聚合酶PolIPolIIPolIIIPolII催化合成DNA的互补链;在生长链的3‘－OH末端同渗进来的核苷酸发生聚合反应。具备条件：四种脱氧核苷酸dNTPs(dATPdGTPdCTPdTTP)；带有3‘－OH游离基团的引物链；DNA模板用途：制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。（三）基因工程的载体载体（Vector）将外源DNA片段带入宿主细胞并进行复制或表达的运载工具。载体设计和应用是DNA体外重组的重要环节。CIAP去除5‘磷酸外源DNA限制性内切酶酶切5‘P3‘OH5’P3‘OH5’P5’P3‘

8、OH3‘OHT4连接酶连接5’OH5’OH3’OH转化E.Coli限制性内切酶酶切载体多克隆位点3’OH筛选重组子，测序载体的发展概况：1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)2.第二阶段：