分子克隆技术讲解课件

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1、植保生物技术讲座05第五讲分子克隆技术克隆载体是用来在生物学寄主和试管间“传送”克隆的序列的DNA分子(如从细菌到试管再到植物细胞)。其共性有四点：1.启动自发复制的能力.2.含有遗传标记(通常是显性的)供选择。3.唯一的限切位点以利于克隆插入的DNA4.非必需DNA序列尽可能少以克隆更大片段。pBR322pBR322pBR322是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切

2、位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。四个重要位点(1)负责质粒复制的rep复制子(来自pMB1;(2)编码Rop蛋白的rop基因，促进不稳定的RNA I–RNA II复合体转变为稳定的复合体并起着减少质粒拷贝数的作用(来自pMB1);(3)编码beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性(来自Tn3转座子);(4)编码四环素抗性蛋白的tet基因(来自pSC101).pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处

3、于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。pUC19pUC18和pUC19小、高拷贝数,长2686bp只有多克隆位点(MCS)排列方向不同pUC18/19含有:(1)pMB1复制子rep(来自pBR322)，因缺失了rop基因和在pMB1的rep复制子

4、单个位点突变而导致了高拷贝数;(2)编码beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性(来自pBR322)，这个基因上有两个点突变，因而不同于pBR322的bla基因;(3)lac操作元的区域含有CAP（代谢物活化蛋白）结合位点,启动子Plac,lac阻遏蛋白结合位点编码beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的lacZ基因的5‘端(来自M13mp18/19).。这个多肽片段的合成可受IPTG诱导，与突变菌(mutationlacZDM15)实现alfa互补。pUC18和pUC19pUC19图pBluescriptII系列均为2961bp长，用于DNA克隆、双脱氧DNA测序、体外诱变和

5、在简单体系中体外转录。pBluescriptIISK和KS这两个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方向不同。pBluescriptII载体上的重要位点(1)f1(IG)–噬菌体f1的基因间区;(2)rep(pMB1)–pMB1的复制子，负责质粒的复制；(3)bla(ApR)–编码beta-内酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的抗性;(4)lacZ基因的5’-端序列，编码编码beta-半乳糖苷酶的N-端多肽，有了这个这个多肽片段，就可以菌落蓝白反应对重组质粒进行筛选pBluescriptIIKS/SKpBluescriptSKM13mp18和M13mp19载体单链、雄性专化的DNA丝

6、状M13的衍生物。两个载体均为7250bp长，其多克隆位点方向相反。在E.coli操作元lac区含CAP蛋白结合位点、启动子Plac、lac阻遏蛋白结合位点和lacZ基因的5’-端序列(lacZ基因的第6-7个密码子被多克隆位点取代)。M13mp18/19结构图多克隆位点Lambda噬菌体Lambda噬菌体是一种大肠杆菌的温和性噬菌体。其DNA是线状的、双链的(48502nt)，两端的5’-端有12个碱基是单链的，碱基互补的。噬菌体DNA注射到菌体内后末端碱基互补而环化。在裂菌循环途径，噬菌体编码复制、溶菌和衣壳蛋白的基因表达。噬菌体DNA复制，复制品被切下来，包装到子代噬菌体粒体中。

7、在溶原循环中，噬菌体基因的表达受到遏制，其DNA通过重组插入到细菌染色体中。Lambda噬菌体唯一切点Lambda噬菌体载体cos质粒是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点是可以用来插入较大的DNA片段，再转入细菌。cos质粒载体一个典型的质粒克隆技术涉及5步1)用限制性内切酶消化DNA样品2)用限制性内切酶消化质粒DNA3)连接样品DNA和质粒DNA的消化产物4)用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞5)涂布在琼脂平板上进行耐抗菌素筛选克隆示意图