《人工染色体》PPT课件

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1、第六章人工染色体生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与成百至上万千碱基的DNA片段相关。复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到大片段DNA的研究。因此，提高载体的容纳量一直是克隆载体的重要发展方向之一。随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入大片段DNA的克隆载体——人工染色体的研究取得了迅速的发展所谓人工染色体——是一类能在生物细胞中独立“稳定存在和遗传的人工重组DNA分子”。酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome

2、,YAC，1000kb）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC，300kb）哺乳类人工染色体（MAC）P1衍生人工染色体现正在研究的人工染色体总结一、YAC的基本序列元件酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）酵母染色体的端粒顺序（TEL）第一节YAC——酵母人工染色体YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel）定位于染色体末端一

3、段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构酵母自主复制序列（ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必需的信号。酵母着丝点(CEN)有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。pYAC4：酵母第四条染色体的着丝粒。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型SUP4：赭石突变抑制基因作用方式：

4、YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。二、克隆策略YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DN

5、A，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体三、YAC克隆系统的特点1、YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb）2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC3、酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境四、YAC克隆系统的缺点首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的现象。其

6、次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。返回第二节细菌人工染色体（BAC）一、BAC特点1、是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高通量低拷贝的质粒载体。2、F因子的特点又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移

7、遗传标记。F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞1～2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC中外源基因的重组和嵌合度带有外源片段的BAC载体在细菌细胞（重组缺陷型，rec－）中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子在细胞内稳定复制而不发生重组，尤其是重复序列多的DNA大分子克隆350kbF因子具有携带1Mb插入片段的潜能，这就使构建具有大容量克隆能力的载体成为可能将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100k

8、b以上的DNA片段。二、BAC载体的结构1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于100kb的DNA。新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒：F因子的parA，parB，parC基因以保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞oriS基因：来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子解旋酶