《酶免检测技术影响》PPT课件

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1、酶免检测技术影响因素检验科马燕酶免技术的分类实验注意事项实验中常见问题及解决方法均相法双抗原夹心法（测抗体）直接法双抗体夹心法（测抗原）酶免法间接法测抗体、抗原EIA非均相法ELISA竞相法测抗体、抗原捕获法测IgM抗体enzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定法酶免技术的分类双抗体夹心法HBsAg、HBeAg双抗原夹心法HBsAb夹心法HBcAb、HBeAb竞争法HDVIgG/M、HEVIgG/M测IgG测IgM间接法HAV-IgM捕获法测IgM实验注意事项1、标本避免溶血尽量新鲜，避免细菌污染一般5

2、天内检测的血清可4℃保存，否则低温保存。2、试剂使用前平衡至室温配置洗液应使用去离子水或蒸馏水，保证水的新鲜3、设计实验设计好孔位，通常阴阳对照孔各2孔、空白1孔。必要时做好标注，避免错误4、加样样品应全部加于反应孔底部，避免液体悬挂在孔壁上。加样量准确！加下一标本时更换吸嘴5、加酶结合物一般使用滴瓶滴加滴加时应保持瓶身垂直、加液速度适中，使液滴大小均匀一致一步法时先加样本后加酶，不可颠倒顺序一般空白孔只加底物和终止液，而不能加入其它物质，尤其是酶结合物6、温育温度、时间要严格控制！最好使反应杯尽快升温到所需温度最好放入湿盒或水浴箱中反应

3、板贴上即时贴微孔板放入水浴箱后，孔内温度上升到37℃需要一定时间。但实际工作中很少有人注意这个问题，通常是放入即计时，导致实际温育时间不够，弱阳性标本漏检。解决：微孔板放水面上或湿盒中纱布浸透水，使板底部直接与37℃接触，迅速达到温度。7、洗板使用专用洗涤液一般洗涤4~6次若手工洗涤，前两次洗涤应不溢出反应孔污染后面几次洗涤应加满所有孔干净每次加洗涤液后应浸泡30秒再甩去洗液反应板倒扣吸水纸上拍干洗板时应注意非离子去垢剂的浓度。洗液中Tween20高于0.2%,可使包被子固相上的抗体抗原解吸附而影响测定下限。8、加底物底物A液通常是H2O

4、2还原剂底物B液通常是TMB（3、3′、5、5′-四甲基联苯胺）氧化剂TMB氧化后呈蓝色，被2NH2SO4终止后呈黄色，450nm波长处有最大吸收峰底物B应避光保存，实验时加完底物A、B保温时也应避光保存。9、比色空白孔校零，读取各孔OD值单波长or双波长的选择：单波长通常是对显色具有最大吸收的450nm或492nm双波长酶标仪则在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下各测定一次。使用双波长时不必设定空白孔，否则会造成孔吸光度数为负数。若底物为OPD（邻苯二胺），波长为492nm若底物为TMB，波长为450nm10、结果判读不同试剂，

5、CUTOFF值计算方法不同项目CUTOFF阳性判断HBsAbHBeAg阴性OD*2.1>cutHBeAb（阴性OD+阳性OD）*0.5

6、羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。4、溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。外源性标本因素：1、溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化物的活性，温育时吸附固相可与HRP显色。2、细菌污染：细菌分泌的一些酶可对抗原抗体蛋白分解或直接影响酶标抗体作用，并且细菌引起标本混浊。3、标本4℃存放过久：IgG聚合成二聚体，间接法中易假阳性。建议<1周4、标本凝固不全：残留纤维蛋白原形成的纤维蛋白块，造成假阳性。现象可能原因解决方法显色淡灵敏度低1、试剂盒未平衡至室温实验前试剂盒置于室温平衡

7、30分钟以上2、水浴箱温度不到37℃调整水浴箱温度至37℃孵育期间不宜多开门3、孵育时间不够校准定时钟、准确定时4、样品加样量偏少校准吸液器吸嘴与移液器接合紧密吸嘴一次性使用5、酶结合物加样量偏少瓶身应垂直滴加，保证液滴最大6、底物作用时间不够延长至标准时间7、样品用叠氮钠防腐，抑制了酶活性与酶一同加入的样品中不能用NaN3防腐8、蒸馏水被污染换用合格蒸馏水或去离子水9、洗涤液配置不当，稀释倍数>1:20准确配置洗涤液10、试剂盒运输时间太长，受高温影响夏天长途运输时，缩短时间，低温措施11、试剂盒失效不适用失效试剂现象可能原因解决方法重

8、复性差1、样品数量较多、加样时间过长重复测定标本时，尽可能使用同一移液器，装紧吸嘴，条件、人员应尽量与上次保持一致，以排除这些因素造成的重复性差的可能性。2、加样量不一致3、孵育时间不一致4、