实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定

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1、实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。3、熟悉分光光度计的使用。【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙

2、转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下。正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力

3、。【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.40.1M的PBS中，定容到100ml。现用现配。2、谷丙转氨酶底物：0.90gL-丙氨酸，29.2mgα-酮戊二酸，先溶于pH7.40.1M的PBS中。然后用1MNaOH调节pH到7.4，再用pH7.40.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。3、0.1mol/LpH7.4PBS：称取13.97gK2HPO4和2

4、.69gKH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。4、0.02%2.4-二硝基苯肼溶液：称取20mg2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/LHCl中。把锥形瓶放在暗处并不时摇动（或加热溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/LHCl定容到100ml。滤入棕色玻璃瓶内置[冰箱内保存]。5、0.4mol/LNaOH：称取16gNaOH定容到1000ml。6、0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl，定容到100ml。【操作方法】一、标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物

5、作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。（总图如下）二、谷丙转氨酶活力的测定（学生只做这个）1、样品的制备（集体制备）将鸡处死

6、，取肝脏后用生理盐水冲洗，滤纸吸干后，称取0.5g肝脏，剪成小块，加入预冷（冰水或冰箱中）的pH7.4的PBS4.5ml，在冰水浴中制成10%的匀浆，4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。（一组按10ml算：10ml*N）2、酶活力的测定：取6支试管，按下表操作： 测定管（A）标准管（S）对照管（B）空白管谷丙转氨酶底物（ml）0.50.5   37℃水浴5min肝匀浆（或血清）（ml）0.1丙酮酸0.1ml0.1水0.1ml 混匀后，37℃水浴准确保温30min2,4-二硝基苯肼（ml）0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物（ml）  0.50.5 混匀

7、后，37℃水浴准确保温20minNaOH（ml）5.05.05.05.0混匀后，静置10minA5203、计算：每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位：D=(A-B)×500/S×2.5=(A-B)×200/SD:每毫升肝脏匀浆谷丙转氨酶活力单位(U/ml)式中A:样品管吸光度值B:对照管吸光度值S:标准管吸光度值500:标准丙酮酸溶液2.5浓度谷丙转氨酶的换算单位系数【注意事项】1.在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2.标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。3.转