葛根素对hela细胞生长的抑制作用机制

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1、郑福禄等葛根素对HeLa细胞生长的抑制作用机制第9期·1881·葛根素对HeLa细胞生长的抑制作用机制郑福禄刘宇鹏孙伟(秦皇岛市第一医院急诊科，河北秦皇岛066000)〔摘要〕目的探讨葛根素对HeLa细胞的作用及其机制。方法以HeLa细胞为试验材料，采用MTT法、比色法和流式细胞术等技术，分析葛根素对HeLa细胞的抑制作用。结果葛根素高、低剂量对HeLa细胞的半数抑制浓度(IC50)分别是48.31μg/ml和37.08μg/ml，提示葛根素不仅可明显抑制细胞生长，而且能显著上调HeLa细胞Caspase-3活性，并存在剂量和时间依赖性;通过对HeLa细胞周期测定，葛

2、根素可影响肿瘤细胞内DNA复制和合成，抑制细胞正常分裂，阻滞细胞进入S期，从而使细胞在G1期堆积，出现G2/M阻滞，有丝分裂终止，从而抑制细胞增殖，导致肿瘤细胞凋亡。结论葛根素在体外能够抑制HeLa细胞生长，其机制可能与抑制细胞有丝分裂从而抑制增殖及上调Caspase-3活性有关。〔关键词〕葛根素;HeLa细胞;生长抑制〔中图分类号〕R737.33〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202(2012)09-1881-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2012.09.046中医药对于宫颈癌有着很好的治疗作用，能改善患者全身(终浓度为22

3、0和440μg/ml)，每个浓度设四个平行复孔，阴性症状，增强机体免疫功能，提高抵抗力，延长生存期，提高远期对照组为等体积RPMI1640完全培养液，并设空白调零孔(只〔1〕疗效。近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成分日益得到人们加完全培养液，不加细胞)，于37℃，5%CO2培养箱中继续培〔2～5〕的重视，其中又以植物提取物居多。葛根素(Puerarin)又养24h，弃去上清，用RPMI1640洗3次，洗去药物，每孔加入名8-β-D葡萄吡喃糖4'，7二羟基异黄酮，是从豆科植物野葛的MTT20μl，继续培养4h后，加入150μlDMSO溶解，10min后干燥根中提取的一种化

4、学成分，是葛根中含量较多的有效成分于酶标仪492nm处测OD值，计算药物的体外生长抑制率，求之一，具有多种药理作用，药效明确，安全低毒，临床应用广泛。出半数抑制浓度(IC50)(见下式)。〔6〕有研究显示，葛根提取物对多种肿瘤生长有抑制作用，但是细胞生长抑制率(%)=(对照组平均OD值－用药组平均有关其主要有效成分葛根素抗肿瘤作用的研究还未见报道。OD值)/对照组平均OD值×100%1.3.3比色法检测Caspase-3活性的变化取对数生长期细1材料与方法胞(5×105/ml)，对照组不加药，用药组加入不同浓度葛根素1.1化学试剂和细胞株葛根素购于陕西太极华青科技有限

5、(终浓度为220和440μg/ml)12、24、48h和72h后，收集细胞，公司。10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养液(含双抗，2000r/min离心5min，以PBS洗2次，尽量去除PBS上清;在pH7.4)和四甲基耦氮唑蓝(MTT)，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液收集的沉淀细胞中加入50μl冰冷LysisBuffer;置冰上裂解(PBS)配成5mg/ml，过滤除菌，4℃避光保存，购于Sigma公司;20min，蜗旋振荡10s，10000r/min，4℃，离心1min;把离心上二甲基亚砜(DMSO)为Amresco公司产品;半胱氨酸蛋白酶清液转移至新的管

6、中，并放置冰上;测定蛋白浓度;吸取50μl(Caspase)-3分光光度法检测试剂盒为南京凯基生物科技发展含50～200μg蛋白的细胞裂解上清，如体积不足50μl用Lysis有限公司产品。所有其他试剂均为分析纯。Buffer补足至总体积50μl;加入50μl的2×ReactionBuffer;加1.2细胞株人宫颈癌HeLa细胞株购自协和医科大学基础入5μlCaspase-3Substrate并于37℃避光孵育4h;用酶标仪在医学研究所细胞中心。λ=405nm测定其吸光值。1.3方法1.3.4流式细胞仪检测细胞周期的变化取对照组和葛根素1.3.1细胞培养及收集将HeLa

7、细胞单层接种在含10%(终浓度为220和440μg/ml)处理48h后的HeLa细胞单细胞悬6FBS的RPMI-1640(含100U/μl的青霉素和100U/μl的链霉液(1×10/ml)1ml，HeLa细胞上清倒入标记试管中，培养瓶中5加0.25%胰酶消化，消化的HeLa细胞加入对应的试管中，离心素)培养瓶内，完全培养基按1×10的浓度接种在培养瓶内，置入37℃、5%CO2培养箱。3d传代一次，所有试验均在细胞1500r/min、5min，去上清。0.01mol/LpH7.2PBS洗2次，处于对数生长期进行。1500r/min、5min。将70%乙