《物理图谱》PPT课件

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1、第三章物理图绘制§3.1概述§3.2限制性作图§3.3荧光原位杂交§3.4序列标记位点作图§3.5克隆作图§3.6遗传图与物理图的整合§3Physicalmapping§3.1概述为什么要进行物理作图？遗传学图谱分辨率有限遗传学图的分辨率依赖于得到的交换的数目。对于人类与大多数真核生物来说，巨大数量的后代不易获得。遗传学图谱精确度有限酿酒酵母chr3遗传图与物理图的比较§3Physicalmapping§3.1概述结构基因组学的发展：遗传作图物理作图基因组测序染色体DNA作图文库物理图谱大分子DNA的提取大片段DNA的克隆物理作图物理作图的主要环节§3Physicalmap

2、ping§3.1概述物理作图的主要方法限制性作图（restrictionmapping)荧光原位杂交（fluorescenthybridization,FISH)序列标签位点（STS)作图（sequencetaggedsitesmapping)§3Physicalmapping§3.1概述限制性作图定义：将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。局限性：只能应用于相对较小的DNA分子。§3Physicalmapping§3.2限制酶作图限制性作图的基本原理比较一种DNA分子被不同限制性内切酶切割所产生的片段大小。首先用一种酶处理样品后，电泳确定DNA片段的大小。然后用第二

3、种酶处理，获得第二组片段。最后用两种酶混合处理，获得第三组片段。收集上述资料进行对比组装。两种酶切位点交替出现的区段用加减法确定其的相对位置。连续出现2个或多个相同酶切位点的区段，采用部分酶解法。切点过多时可以采用末端同位素标记结合部分酶解进行绘图。§3Physicalmapping§3.2限制酶作图§3Physicalmapping§3.2限制酶作图限制酶作图的基本方法8结论：图谱II是正确的双限制性酶切图解片段结论0.2kb,0.5kb必然来自0.7kb的BamHI片段，其中有一个EcoRI的位点1.0kb这必然是一个不含EcoRI位点的BamHI片段，如果我们如下放置

4、1.0kb的片段，就可以解释1.5kbEcoRI片段的出现1.2kb,2.0kb这必然也是不含EcoRI位点的BamHI片段，它们必须位于3.4kb的EcoRI片段中。这样就有两种可能：BamHI部分限制性酶切的预测如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括1.2+0.7=1.9kb的片段如果图谱I是正确的，不完全消化产物应该包括2.0+0.7=2.7kb的片段BamHI亚适条件限制性作图的规模受限于限制性片段的大小限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分

5、子。实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用识别6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。§3Physicalmapping§3.2限制酶作图§3Physicalmapping§3.2限制酶作图大于50kb的基因组能否用限制性作图？答案是肯定的。通过选择靶DNA分子中的稀有酶切位点酶可以克服限制性酶切作图的局限性。稀有切点内切酶:在基因组DNA顺序中只有很少可识别序列的限制酶,一般识别位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比。稀有切点限制酶分为两大类：识别具有7或8个核苷酸序列的酶；识别序列包含靶DNA稀少基序的酶。选用稀有切点限制酶的注意事项识别顺序越长产生

6、的片段越大，但当识别位点含非特异顺序时，片段长度小于预期；识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小。高等生物基因组一般A/T比较高,应选G/C高比例限制酶,如-GCGGCCGC-(NotI)限制酶识别位点较长，即使高等真核生物基因组也没有这种序列，可以通过转座或转导将这类酶切位点引入待测基因组；基因组DNA甲基化对酶切位点出现频率的影响。高等生物基因组DNA甲基化比例很高,但果蝇和酵母基因组无甲基化。§3Physicalmapping§3.2限制酶作图稀有切点限制酶在物理作图中的应用低等生物基因组物理作图大分子DNA克隆片段的物理作图§3Physicalmapping§3.2

7、限制酶作图§3Physicalmapping§3.2限制酶作图选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小1)根据稀有酶切位点限制酶识别碱基数推测产生的DNA片段长段:NotI酶:GC/GGCCGC48=74536bp=75kbI-SceI酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT418=90000000bp=90000kb2)由于多细胞真核生物基因组DNA存在大量的甲基化位点,识别CG序列的稀有酶切点限制酶实际产生的DNA片段比预期大得多.如NotI酶切人类基因组DNA产生的片段常在20