《双向琼脂扩散试》PPT课件

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1、双向琼脂扩散试验授课对象：临床医学专业八年制本科授课教员：汤玉瑜授课单位：第三军医大学基础部免疫学教研室教学重点琼脂的制备方法双向琼脂扩散实验的原理实验目的掌握双向琼脂扩散试验的原理理解琼脂的制备方法了解双向琼脂扩散实验的应用教学难点如何根据沉淀线判断抗原或抗体的浓度使用教材《免疫学实验》第一版朱道银吴玉章科学出版社2008参考书《免疫学》第四版龚非力科学出版社2007《MedicalImmunology》10th，T.G.Parslow推荐网站医学免疫学网络教学http://192.168.10.21/mta/美国国立生物技术信息中心：http://www.ncb

2、i.nlm.nih.gov中国生物信息网：http://www.biosino.org概述临床免疫检验技术的出现最早可追溯至19世纪末。1896年，Widal发现在伤寒杆菌中加入伤寒病菌人的血清可致伤寒杆菌发生特异的凝集现象，利用这种凝集现象可有效的诊断伤寒病，这就是最早用于病原体感染诊断的免疫凝集试验，亦即著名的肥达试验(Widaltest)。常见的免疫检验技术：经典的免疫学反应凝集反应沉淀反应补体结合反应中和反应免疫电泳技术免疫标记技术免疫荧光免疫酶技术放射免疫测定抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是抗原与相应抗体之间所发生的特异性

3、结合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。兰德施泰纳，1868年--1943年，普林斯顿洛克菲勒医学研究所，发现人的主要血型系统而获1930年诺贝尔生理学或医学奖。他最初研究化学,1896年後对血清学和免疫学产生兴趣,将化学方法引入血清学研究,发现不同人的血清与血细胞混合後可发生凝集反应,1901年用抗A血清和抗B血清将血液分成A﹑B﹑C(後称O)三型。沉淀反应（precipitation）是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。影响沉淀反应的主要因素1.

4、抗原、抗体反应的浓度、比例2.电解质3.温度4.酸碱度可溶性抗原相应抗体+沉淀线或沉淀环分类沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应琼脂扩散试验双向扩散单向扩散＋电泳技术火箭免疫电泳对流免疫电泳Question:怎样才能在无特殊仪器设备而又操作简便的定性检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等？实验原理可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂糖凝胶板的对应孔中各自向四周自由扩散,若两者分子比例适当,则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线.沉淀物形成的主要原是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分.免疫复合物的形成通常经过两步

5、:抗原与抗体的特异性结合;形成肉眼可见的免疫复合物晶格1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定双向琼脂扩散试验的应用AgAbABCDEFA:浓度Ag、Ab及扩散率近似；B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab；C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab；D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似；E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab；F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab；检测未知抗原或抗体1:待检Ag2:标准Ag待检Ag与标准抗原完全吻合待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应待检Ag有与Ab相对应的Ag,但与标准Ag不同

6、待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低抗原性质分析1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。3.可进行任意稀释。抗体效价滴定“1”为单一抗原抗体系统。“n”为多个抗原抗体系统。*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。抗原抗体纯度鉴定*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。单向免疫扩散将一定量的抗体混入琼脂糖凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。是一种定量试验，一般是用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。应用这一实验方

7、法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的水平。1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找相应抗原浓度绘制标准曲线标准品抗原浓度测定不同病人抗原浓度测定影响因素1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长5.扩散温度：4～37℃内温度与扩散速度正相关实验材料1．人血清.2.兔抗人IgG。3．琼脂糖凝胶板，1%生理盐水。4．其他：加样器、3mm打孔器、模板、湿盒、恒温箱等。实验方法1．琼脂板的制备将载玻片置于水平台上，吸管吸取加热融