琼脂免疫扩散试验.ppt

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1、琼脂免疫扩散试验一、相关知识介绍可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。二、琼脂扩散原理1％~2%琼脂凝胶所形成的构架网孔较大，空隙中是98％~99%的水，允许分子量在20万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在20万以下，因此可以在琼脂凝胶中自由

2、扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生特异性免疫结合反应，结合物分子量一般大于20万，此结合物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。三、琼脂扩散的种类琼脂扩散反应根据其扩散方向可分单相（向）扩散和双相扩散，根据抗原抗体二者是一方扩散还是双方扩散，又有单扩散和双扩散之别。因此，琼脂扩散反应就有单相单扩散、单相双扩散，双相扩散、双相双扩散4种类型。四、以诊断禽流感为例讲解双相双扩散（一）材料与试剂1．标准禽流感诊断血清，购买自生物制品所。2．标准禽流感诊断抗原，购买自生物制品所。3．待检血清4．琼脂板5．打孔器（二）操作方法（

3、步骤）1．凝胶的配制称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入8%盐水，水浴煮沸融化20min。2．制板将融化的琼脂倒入平板上，使厚度2mm～3mm。自然冷却。3．打孔根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。打成梅花形孔（共7孔）。用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。4．挑孔挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。5．封底把溶化琼脂7uL左右加入孔中，以免加样后液体从孔底渗漏。6．加样以加样器（枪）吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应

4、程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。7．放置加样完毕后，37℃自由扩散24h～48h。（三）结果判定当标准阳性血清孔与抗原之间出现一条明显致密的沉淀线时，再进行被检血清孔的判定。若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。