《凝胶过滤层析》PPT课件

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1、凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography,GFC定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（sizeexclusionchromatography）、分子筛层析（MolecularSieveChromatography）、凝胶渗透层析（GelPermeationChromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此

2、相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡

3、聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出固定相（凝胶）三维空间网状结构样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出分子筛效应：按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。基本概念外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液

4、的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）分配系数（Kd）Ve=Vo+KdVi(2)Ve=Vo+Vi，Kd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出(1)Ve=Vo，Kd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里最先流出(3)0

5、葡聚糖凝胶：Sephadex?聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl?琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel?其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。基本骨架：葡聚糖（dextran）;交联剂：3-氯-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸

6、水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大SephadexG系列凝胶的分级范围G10<700DG15<1,500G251,000~5,000G-501,500~30,000G-753,000~70,000G1004,000~150,000G1505,000~400,000G2005,000~800,000交联葡聚糖凝胶的化学结构葡聚糖凝胶1．理化性质葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理

7、化性质在水中的有明显的差异：膨胀度(床体积)吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量)筛孔的大小分级范围葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样分类以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。2．稳定性葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定

8、的、不溶解的，而且很少产生化学降解。在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。在0.1mol／LHCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／LHCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。3．吸附性葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶