环境工程微生物实验指导书

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1、实验一光学显微镜的操作及细菌形态观察1.1实验目的(1)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养。(2)观察几种典型细菌的形态与构造，学会绘制微生物图。1.2实验器材显微镜、二甲苯、香柏油、载玻片、盖玻片、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、球衣菌、假单胞菌、固氮菌标本片。1.3显微镜的结构及其操作方法1.3.1普通光学显微镜(LightMicroscope)1.3.1.1光学显微镜的结构和各部件作用观察、检验微生物通常用光学生物显微镜（见图1-1），显微镜分机械装置和光学系统两部分。一机械装置(1

2、)镜筒：镜筒长度一般是160cm。它的上端装目镜，下端装物镜回转板。回转板上一般有三个物镜。(2)转换器：位于镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个孔或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。(3)载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧夹，用以固定标本或载破片。有的载物台上装有自动推物器。(4)调节器：镜筒旁有两个螺旋，大的叫粗调节器，小的叫细调节器，用以升降镜筒，调节物镜与被观察物体之间的距离。二光学光学系统26（1）目镜：一般使用的显微镜具有2—3个目镜，其上刻有“5×”

3、、“10×”、“15×”(或“16×”)等数字及符号，意即放大5倍、10倍、15倍(16倍)。这三种透镜的焦距分别为50mm、25nn、16mm，线视场分别为20mm、14mm、10mm。（2）物镜：物镜装在回转板上，可分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种。相应的放大倍数是10×（5×）、40×（50×）、100×（90×），相应的工作距离是7.63mm、0.5mm、0.198mm，物镜上常标注数值孔径（N.A）。使用低倍镜和高倍镜时，一般做活体观察，不进行染色。在观察原生动物时，低倍镜主要用来观察全部原生动物的种类

4、和观察它的活动状态，而高倍镜则可以看清楚微生物的结构特征。油镜在大多数情况下是用来观察染色的涂片。（3）集光器集光器在载物台的下面，用来集合反光镜反射来的光线。集光器可以上下调整，中央装有光圈，可以调整光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把集光器向下移动。（4）反光镜反光镜装在显微镜的最下方，有平凹面反光镜。1.3.1.2光学显微镜的分辨率与放大倍数26显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。光学显微镜的分辨率受光干涉现象的限制。分辨率（最小可分辨距离）=1/2光波波长/数值孔径（1-1）D=λ

5、/2n·sin(α/2)（1-2）N.A.=nSin(α/2)（1-3）式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。N.A：数值孔径。λ：可见光的波长（平均0.55mm）。n：物镜和被检标本间介质的折射率。a：镜口角（即入射角），该角度决定于物镜的直径和焦距见图（1-2）。例如：最大入射角为120°，其半角的正弦为sin60=0.87，以空气为介质时，N.A=1×0.87=0.87；以水为介质时，N.A.=1.33×0.87=1.15；以香柏油为介质时，N.A.=1.52×0.87=1.31，见图（1-3）。肉眼所能

6、感受光波的波长从200mm（紫光）到700nm（红光）。设感受光波的平均长度为550nm（0.55um），N.A.=1.25，则分辨率=1/2×0.55/1.25=0.22um，而细菌大小从0.5～2um，故正好看到细菌。用紫光光源效果更好。显微镜的总放大倍数等于物镜与目镜放大倍数的乘积。即：显微镜的放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数观察微生物时，常用放大10倍或15倍的目镜。目镜装在镜筒上端，在使用过程中并不经常变动，通常所谓的低倍镜、高倍镜或油镜的观察，主要是指使用不同物镜而言。例如使用10×目镜和40

7、×物镜（高倍镜）所得物象的放大倍数是400倍。油镜的放大倍数是最大的（90`或100倍）。放大倍数这样大的镜头，焦距就很短，直径就很小，从标本片透过来的光线，因介质密度不同（从标本片进入空气，再进入油镜），有些光线因折射或全反射，不能进入镜头，致使进入的光线较少，物象显相不清。所以为了不使通过的光线有所损失，须在物镜和标本片中间加入与玻璃折射率（n=1.52）相仿的油（香柏油，n=1.55）。因为这种物镜使用时须加香柏油，所以我们称它为油镜。一般的低倍镜或高倍镜使用时不加油，所以也称干镜。261.3.1.3光学显

8、微镜的使用与保管一低倍镜的使用方法（1）置显微镜于固定的桌上，窗外不宜有障碍视线之物：（2）拨动回转板，把低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒连接而直对；（3）拨动反光镜向着光线的来源处(对光时应避免太阳直射，可向着自然光日光灯或显微镜照明灯)。同时用肉眼对准目镜(选用适当放大倍数的目镜)仔细观察，调节反光镜(光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜)