实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定

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1、酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应存在于人的肝脏，前列腺等处植物中以发芽的种子中含量最为丰富。是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。一、概述酶液磷酸苯二钠苯酚＋磷酸氢二钠folin-酚测定酚的浓度计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）根据双倒数法计算出Km及Vmax二、实验原理V=Vmax[S][S]Km+三、实验步骤：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线3、制作酚标准曲线4、[S]与V0关系实验5、双倒数作

2、图法计算Vmax和KmbuffersubstrateenzymeCertainTimeblankStopthereactionColordeveloped生化实验课老师：于晓虹实验报告请交到讲台上来酶液稀释　　取上清液３００微升，稀释３０倍，用大试管装科代表　　李博恒1、磷酸酶原液的制备：称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。上清液用pH5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。2、制作

3、酶反应时间与产物生成量的关系曲线（目的：选取合适的反应时间）加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.50.50.50.50.50.5精确反应时间3510152025碳酸钠溶液2222222酶液－－－－－－0.5Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5Folin－酚溶液已稀释好！注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始35℃保温10分钟0123456反应时间03510152025吸光度结果：以反应时间为横坐标，A680nm

4、为纵坐标，绘制反应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。3、制作酚标准曲线（目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）0123456780.4mMphenolstandardsolution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21MNa2CO3222222222Folin-phenolreagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加液程序表

5、35℃保温10分钟012345678酚含量/μmol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度结果：以酚含量（μmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各管的吸光度（A680nm）。4、[S]与V0关系实验实验加液程序表管号1234560磷酸苯二钠0.100.150.200.250.300.500.50醋酸缓冲液0.400.350.300.250.20--酶液0.500.500.500.500.500.50-

6、精确反应15分钟35度碳酸钠溶液2222222Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5酶液－－－－－－0.535℃保温10分钟测680nm处吸光度注：进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始实验中需注意事项：酶反应作用时间精确控制Tubenumber123456[S](mM)0.50.7511.251.52.51/[S]A680phenolcontent（酚含量）V0(μmolephenolpermin)1/V0实验结果1、酚含量从酚标准曲线上查得2、V0反应初速率（μm

7、ol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟）。3、双倒数作图法计算Vmax和Km